口服胰岛素肠溶聚合物脂质杂化纳米粒的制备与评价

为了提高胰岛素的口服生物利用度,本研究以聚乙二醇聚乳酸共聚物(PEG-PLA)为高分子载体材料、磷脂s75为脂质材料、Eudragit L100为肠溶材料制备口服胰岛素肠溶聚合物脂质杂化纳米粒(INS-NPs L100),并对其体内外性能进行评价。采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备胰岛素聚合物脂质杂化纳米粒(INS-NPs),以包封率、粒径和释药行为为评价指标,采用单因素法对处方进行优化;将最优INS-NPs与肠溶材料Eudragit^■L100混合制备成INS-NPs L100,并对其形态、体外释放及健康大鼠灌胃后的降血糖作用进行评价。以最优处方制备的INS-NPs包封率为(62.18±4.51)%,平均粒径为(225.2±94.3)nm,多分散系数为0.191±0.068,Zeta电位为-(14.84±1.26)mV。包裹肠溶材料后所制备的INS-NPs L100,在pH1.0盐酸溶液中2h累积释放量为8.01%,在pH6.8的磷酸盐缓冲液中6h累积释放量为67.31%。将所制备的INS-NPs L100经口给予健康大鼠(38IU/kg)后,具有明显的持续降血糖作用,3.5h时血糖浓度可降至初始值的76%。实验结果表明,本研究所制备的INS-NPsL100可有效减缓胰岛素在胃液中的释放速度,提高蛋白在胃肠道中的稳定性,为多肽、蛋白类药物口服给药提供了新的研究思路。

黄芩素脂质聚合物纳米粒对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制研究

目的 观察TAT肽修饰的载黄芩素(Bai)脂质聚合物纳米粒(Bai-TAT-LPNs)对心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用及潜在机制。方法 纳米沉淀法构建Bai-TAT-LPNs;建立心肌缺血再灌注损伤模型大鼠,以Bai作为阳性对照药,在缺血前4 h腹腔注射Bai-TAT-LPNs;生理记录仪和血生化仪检测大鼠血流动力学和血清指标变化;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡;蛋白印记实验检测心肌cleaved-caspase 3、Bcl-2、p-Akt蛋白表达变化。结果 Bai-TAT-LPNs外观呈均一的球形,平均粒径为(127.0±2.6)nm。Bai-TAT-LPNs(含Bai 100 mg/kg)可显著升高模型大鼠LVDP、+dp/dt_(max)和-dp/dt_(max)(P<0.01);降低血清LDH、CK、MDA水平,并升高SOD水平(P<0.01);还可抑制心肌细胞凋亡(P<0.01)。同时,Bai-TAT-LPNs下调模型大鼠心肌cleaved-caspase 3蛋白表达,并上调Bcl-2和p-Akt蛋白表达(P<0.01)。Bai-TAT-LPNs的上述作用均优于Bai。结论 Bai-TAT-LPNs可改善大鼠心肌缺血再灌注损伤,且效果优于Bai;该作用可能与增强药物穿膜作用、减轻氧化损伤和激活Akt信号有关。

双配体修饰脂质聚合物杂化纳米粒的制备及细胞摄取研究

目的制备双修饰的主动心肌靶向的载荧光探针香豆素-6(C-6)的脂质-聚合物杂化纳米粒(LPHNs),并考察其细胞摄取。方法通过巯基化反应,合成导向化合物心肌细胞靶向肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PCM-PEG-DSPE)。选取C-6为荧光探针,采用自动组装法制备包载C-6的LPHNs,再通过插入法,用PCM和细胞穿膜肽(TAT)对C-6-LPHNs进行修饰。以心肌细胞(H9C2)为模型做体外细胞摄取实验。结果双修饰的C-6-LPHNs的平均粒径为74.5±4.2 nm,分散系数(PDI)为0.051±0.013,Zeta电位为-32.8±1.2 mV,包封率为87.04%±3.19%。双修饰的C-6-LPHNs对H9C2心肌细胞的摄取率明显高于未修饰的C-6-LPHNs。结论LPHNs经双修饰后可促进H9C2心肌细胞的摄取。

黄芩素脂质聚合物纳米粒构建及对脑缺血性眩晕模型大鼠作用的研究

目的 构建TAT修饰的载黄芩素(Bai)脂质聚合物纳米粒(Bai-TAT-LPNs),观察其对脑缺血性眩晕模型大鼠的影响及作用机制。方法 纳米沉淀法制备Bai-TAT-LPN,透射电镜和纳米颗粒分析仪分别记录其表面形貌和粒径。32只健康SPF级雄性SD大鼠采用简单随机分组法分为假手术组、模型组、Bai组和Bai-TAT-LPNs组,每组8只。模型组、Bai组和Bai-TAT-LPNs组大鼠手术结扎颈总动脉和锁骨下动脉构建脑缺血性眩晕大鼠模型,假手术组大鼠只手术但不结扎处理。Bai组和Bai-TAT-LPNs组大鼠按100 mg/kg剂量分别给予Bai、Bai-TAT-LPNs腹腔注射,模型组大鼠给予等体积生理盐水腹腔注射,每天1次,共5天。跳台实验检测大鼠跳台潜伏期(SDL),激光多普勒血流仪检测大鼠前庭神经核组织血流量降率,血生化仪检测大鼠脑组织乳酸(LAC)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平,免疫组织化学法检测大脑海马组织脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达水平。结果 Bai-TAT-LPNs平均粒径为(127±2.6)nm,呈均一的球形。与假手术组比较,模型组大鼠SDL明显延长[(188.56±92.33)s比(46.80±25.18)s,P<0.01],前庭神经核组织血流量降率显著增加[5 min:(18.93±1.75)%比(1.11±0.09)%;10 min:(20.55±1.90)%比(1.9±0.10)%;15 min:(22.33±2.06)%比(1.89±0.16)%;20 min:(25.87±2.52)%比(2.68±0.25)%;25 min:(28.88±2.37)%比(2.89±0.27)%;30 min:(32.68±3.36)%比(3.20±0.30)%,P均<0.01];脑组织LAC、LDH和MDA水平增加[LAC:(810.22±132.37)μmol/gProt比(666.52±119.87)μmol/gProt,P<0.05;LDH:(3.29±0.27)U/μgProt比(2.62±0.21)U/μgProt,P<0.01;MDA:(1.85±0.13)nmol/mgProt比(1.85±0.13)nmol/mgProt,P<0.01],SOD水平降低[(129.88±13.25)U/gProt比(190.02±22.03)U/gProt,P<0.01];脑组织BDNF蛋白表达水平降低[(2889.58±525.6)比(3252.25±396.60),P<0.01]。与模型组比较,Bai组和Bai-TAT-LPNs大鼠SDL显著缩短[(101.52±60.32)s、(56.58±25.78)s比(188.56±92.33)s,P均<0.01],以Bai-TAT-LPNs组更显著[(56.58±25.78)s比(101.52±60.32)s;P<0.01];Bai-TAT-LPNs组大鼠脑组织LAC、MDA及LDH水平显著降低[LAC:(670.32±107.02)μmol/gProt比(810.22±132.37)μmol/gProt,P<0.05;LDH:(2.61±0.18)U/μgProt比(3.29±0.27)U/μgProt,P<0.01;MDA:(1.21±0.11)nmol/mgProt比(1.85±0.13)nmol/mgProt,P<0.05或P<0.01],SOD水平显著升高[(167.83±15.25)U/gProt比(129.88±13.25)U/gProt,P<0.01];Bai组和Bai-TAT-LPNs大鼠脑组织BDNF蛋白表达水平显著增加[(6612.18±896.62)、(9256.66±958.68)比(2889.58±525.6),P均<0.01],以Bai-TAT-LPNs组更显著[(9256.66±958.68)比(6612.18±896.62),P<0.01]。结论Bai-TAT-LPNs对脑缺血性眩晕模型大鼠具有较好的预防作用,作用机制可能与增加前庭核血流量、抗氧化损伤及上调脑海马组织BDNF蛋白表达有关。

羟基喜树碱脂质聚合物杂化纳米粒的制备及体内外性能评价

目的以二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000],DSPE-PEG2000),大豆卵磷脂(soy lecithin-100M,SL-100M),共聚物材料聚乳酸(polylactic acid,PLA),聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA),聚己内酯(polycaprolactone,PCL)为载体包载羟基喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT),采用乳化溶剂挥发法制备HCPT脂质聚合物杂化纳米粒(hydroxycamptothecin lipid-polymer hybrid nanoparticles,HCPT-LPNs),以期提高制剂的载药量并改善其体外血浆稳定性,体外释放性能,体外抗肿瘤活性,体内药代动力学效果以及体内肿瘤抑制效果。方法以粒径、多分散指数、电位为评价指标,采用单因素考察法筛选出HCPT-LPNs的最优处方工艺。以不同聚合物(PLA,PLGA,PCL)为HCPT-LPNs的内核,比较其在10%大鼠血浆中的稳定性。以不同pH值的缓冲液作为释放介质,考察HCPT-LPNs的体外释放情况。以游离的HCPT作为参比制剂,用MTT法测定HCPT-LPNs对MCF-7细胞的体外细胞毒性,考察HCPT-LPNs在大鼠体内药物代谢动力学特性。结果PLA及PLGA内核的HCPT-LPNs较PCL内核的HCPT-LPNs相比具有较好的血浆胶体稳定性。HCPT-LPNs具有pH敏感的释放特性。HCPT-LPNs的体外细胞毒性较游离HCPT大。结论HCPT-LPNs为安全有效的递送HCPT的纳米制剂。

载芍药苷的甘草次酸修饰脂质聚合物杂化纳米粒体内靶向性分析

目的:制备甘草次酸修饰的芍药苷(Pae)脂质聚合物杂化纳米粒(GA-LPHNPs-Pae),并进行理化性质表征和体内靶向性评价。方法:采用两步法制备GA-LPHNPs-Pae,采用葡聚糖凝胶柱分离法进行GA-LPHNPs-Pae的纯化及包封率测定。SPF级昆明小鼠尾静脉注射2.8 ml·kg^(-1)剂量后,采用Q Exactive Focus高分辨液质联用仪分析15,30,45,60,90,120,240 min时间点血液及心、肝、脾、肺、肾组织中Pae的分布情况。结果:所制备的GA-LPHNPs-Pae外观圆整、分布均匀,粒径、分散指数和Zeta电位分别为(96.98±0.39)nm、(0.104±0.005)、(-13.10±0.26)mV,包封率41.6%~52.3%。给药后15,45,60,240 min时,GA-LPHNPs-Pae组血药浓度均显著高于溶液组(P<0.01);心脏、脾脏、肺脏中,GA-LPHNPs-Pae组和溶液组Pae含量均随时间下降,但在脾脏中药量蓄积峰值延后15 min。GA-LPHNPs-Pae组肾脏中药物消除速度4 h内不断下降,但远低于溶液组(P<0.01)。在肝脏中GA-LPHNPs-Pae组Pae含量一直高于溶液组(P<0.01)。结论:成功制备GA-LPHNPs-Pae,体内初步的靶向性分析表明,GA-LPHNPs-Pae可显著提高4h内Pae的肝脏组织蓄积量,显著延长其在小鼠体内的循环时间,尤其是在肝脏中的滞留时间,表明其具备肝靶向性。

核-壳结构的脂质-聚合物杂化纳米粒的研究进展

核-壳结构的脂质-聚合物杂化纳米粒(CSLPHNs)是以具有生物可降解性的聚合物纳米粒为核,外层包覆单层或多层具有生物膜仿生性的脂质壳而形成,结合了纳米粒和脂质体的双重优点,具有粒径小、载药量高、生物相容性好及缓控释给药等优势,在药物递送系统中应用甚广。笔者在查阅近年国内外文献的基础上归纳了CSLPHNs的基本特性、制备方法及在眼部给药、肿瘤治疗及临床诊断成像中的最新研究进展。

载芍药苷的甘草次酸修饰脂质聚合物杂化纳米粒的理化性质表征及体外靶向性评价

目的制备载芍药苷的甘草次酸修饰的脂质聚合物杂化纳米粒(GA-LPHNPs-Pae),对其理化性质进行表征并评价体外靶向性。方法采用两步法制备GA-LPHNPs-Pae,进行外观、粒径与分布、电位、包封率、释放度、红外分析及HepG2细胞摄取靶向定性评价。结果所制备的GA-LPHNPs-Pae外观圆整、分布均匀;粒径、多分散指数和Zeta电位分别为(96.98±0.39)nm、(0.104±0.005)、(-13.10±0.26)mV;红外分析可见甘草次酸特征峰;葡聚糖凝胶柱法测得包封率在41.6%~52.3%;24 h内释放速度先快后慢,2~12 h内释放速度显著下降,曲线平缓,12 h后释放缓慢。以FITC作为荧光探针,以50μg·mL^(-1)浓度NPs-Pae和GALPHNPs-Pae分散液与HepG2细胞共孵育,在2 h时,HepG2细胞摄取GA-LPHNPs-Pae明显优于未修饰的NPs-Pae。结论本文所制备的GA-LPHNPs-Pae外观圆整、分布均匀,对水溶性成分芍药苷包封良好,体外释放缓慢,初步验证对HepG2细胞具有靶向亲和作用。

脂质聚合物杂交纳米粒的研究进展

脂质聚合物杂交纳米粒(Lipid polymerhybrid nanoparticles,LPHNPs)是一种新型载药系统,该纳米粒由修饰亲水性聚合物的脂质外壳包裹疏水性聚合物内核组成,LPHNPs具有较高的结构完整性、良好的生物相容性和载药量及制备材料多样化等优点,使得其在药物递送、诊断成像、基因治疗领域被广泛研究。现主要对LPHNPs的基本特点、结构、制备方法及应用进行综述,以期为后续研究提供参考。

穿心莲内酯脂质聚合物纳米粒对脓毒血症大鼠肾损伤的保护作用研究

目的构建穿心莲内酯脂质聚合物纳米粒(AG-LPNs),探讨其对于脓毒血症大鼠肾损伤的保护作用。方法纳米沉淀法制备AG-LPNs,激光粒度仪检测粒径和电位值,透射电镜观察其表面形貌。采用盲肠结扎穿孔法建立脓毒血症模型大鼠,设立模型组、穿心莲内酯(AG)组和AG-LPNs组,同时设立假手术组。AG组和AG-LPNs组给予AG量为50 mg/kg,假手术组和模型组给予等体积生理盐水,每12小时给药1次,连续灌胃给药3 d。生化仪测定血清Scr和BUN,以及尿液NGAL和KIM-1的含量;TUNEL染色检测细胞凋亡;HE染色检测组织病理变化;蛋白印记实验检测Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达。结果AG-LPNs的平均动力学直径分别为(180±23)nm,Zeta电位为(-18±2.6)mV,其包封率和载药量分别为86%和12%。AG-LPNs外观呈均一的球形,可见明显的核壳结构。脓毒血症模型大鼠血清Scr和BUN显著升高,尿液中NGAL和KIM-1明显增加,肾脏细胞凋亡指数明显升高(P<0.01);AG和AG-LPNs治疗可降低Scr、BUN、NGAL、KIM-1水平和肾脏细胞凋亡指数(P<0.01),其中AG-LPNs的作用更显著(P<0.01)。模型大鼠肾脏组织可见明显的组织学损伤,AG和AG-LPNs治疗后出现显著改善,其中AG-LPNs的改善作用更为明显。模型大鼠肾脏组织Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达显著上调,Bcl-2蛋白表达明显下调(P<0.01)。AG和AG-LPNs治疗可下调Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达(P<0.01),其中AG-LPNs作用更显著(P<0.01)。结论与AG相比,AG-LPNs对脓毒血症大鼠肾损伤具有更强的保护作用,这可能与AG-LPNs较强的抗凋亡作用有关。

核壳脂质聚合物混合纳米粒制备的研究进展

目的介绍核壳脂质聚合物混合纳米粒的制备方法。方法以国外30篇相关文献为依据,综述了核壳脂质聚合物混合纳米粒的特点及优势,介绍了该制剂的结构类型、组分构成、制备方法及影响因素。结果核壳脂质聚合物混合纳米粒可以作为疏水性和亲水性药物及基因的载体。结论核壳脂质聚合物混合纳米粒作为药物递送系统具有广阔的应用前景,制备方法仍需继续探索。

水飞蓟宾固体脂质纳米粒的制备及抗肝纤维化作用

目的制备载中药水飞蓟宾(SIL)的固体脂质纳米粒(SLN),并观察其对肝硬化模型大鼠的抗肝纤维化作用。方法采用高压乳匀法制备SIL-SLN,实验大鼠分为正常对照组、模型对照组、SIL普通剂型组、SIL-SLN灌胃组和SIL-SLN静脉注射组,比较SIL的SLN剂型与普通剂型的抗肝纤维化作用。结果高压乳匀法制备的SIL-SLN呈圆形,形态规则,粒径为(157±8)nm,Zeta电位为(-35.36±2.68)mV,平均包封率为95.64%,平均SIL含量为1.501 g/L。给药8周后,SIL-SLN灌胃组和SIL-SLN静脉注射组的大鼠肝脏Masson胶原染色图像分析灰度值分别为4.73±1.35和2.26±0.42,与SIL普通剂型组(7.26±1.72)比较差异有显著性(P<0.05),且SIL-SLN静脉注射组作用优于SIL-SLN灌胃组(P<0.05)。结论SIL-SLN可显著提高SIL的抗肝纤维化作用,静脉注射作用更强,是一种新型中药靶向制剂。

蟾毒配基脂质-蛋白杂化纳米粒的制备及评价

目的采用搅拌超声法制备蟾毒配基脂质-蛋白杂化纳米粒,延缓药物的体外释放。方法以单因素考察法优化处方及制备工艺,并应用透射电镜观察制剂形态,动态光散射法测定粒径和ζ-电位,差示扫描量热法和X-射线衍射法表征药物在制剂中的存在形式,透析法考察纳米粒及溶液剂中药物的释放行为。结果纳米粒外观圆整均匀,平均粒径为(82.4±28.5)nm,ζ-电位为-19.44 m V,药物在制剂中以无定形态存在,与溶液剂相比,纳米粒可显著延缓药物释放,其释放行为符合Weibull模型,释放机制以扩散为主。结论利用搅拌超声法,以白蛋白和卵磷脂作为载体和稳定剂制备的脂质-蛋白杂化纳米粒可显著延缓蟾毒配基的体外释放。

聚合物基材上的透明硬质自清洁纳米杂化涂层

透明聚合物材料(如聚碳酸酯,PC)具有独特的性能,如轻质、光学透明、电气和机械性能良好,以及易于大规模生产,已成为材料科学中的热门话题。这些材料可在很多领域中代替无机玻璃,包括电子设备的显示板、光盘、眼镜镜片和安全窗等。然而,这些材料的耐刮擦性、耐磨性和耐环境性较差,应用受到很大限制。

拉洛他赛共聚物脂质杂合纳米粒的制备及其性能评价

目的以聚乙二醇-聚己内酯(polyethylene glycol-b-poly caprolactone,m PEG-b-PCL)为聚合物,硬脂酸单双甘油酯(geleol mono and diglycerides Nf,GMD)为固体脂质,制备拉洛他赛共聚物脂质杂合纳米粒(larotaxel-solid lipid core-contained polymeric nanoparticles,LTX-cSLNs)并评价其性能。方法采用透析法制备LTX-cSLNs,以粒径、多分散系数(polydispersity index,PDI)、载药量(drug loading content,wDL)和包封率(entrapment efficiency,wEE)为评价指标,采用单一因素法筛选最优处方工艺。采用高效液相色谱法测定LTX-cSLNs的wDL和wEE,激光散射粒度测定仪测定粒径和电位,采用透射电镜观察形态,采用差示扫描量热法测定GMD在纳米粒内核的存在形式。同时以不含GMD的纳米粒(larotaxel-solid lipid core-uncontained polymeric nanoparticles,LTX-u SLNs)作为对照,比较两种制剂在临界聚集质量浓度(critical aggregation concentration,ρCAC)以及体内外性能的差异。结果 LTXcSLNs帯有脂质内核,平均粒径为56.8 nm,zeta电位为-13.56 m V,wDL为12.9%,wEE为81.46%,ρCAC为0.126 mg·L^(-1)。LTX-cSLNs能够延缓累积释放量达12%,药时曲线下面积(AUC0-t)提高近16.7%。结论 LTX-cSLNs具有高载药量、高稳定性以及良好的体内外性能。

一种烟碱固体脂质纳米粒杀虫剂的制备与优化

针对传统烟碱类杀虫剂易污染环境的问题,设计开发了一种处方材料、生产过程都相对环保的烟碱固体脂质纳米粒杀虫剂.实验结果表明:烟碱固体脂质纳米粒的最优处方为8.5%的氢化葵花籽油(脂质)、2.0%的聚乙烯醇61000(稳定剂)、1.5%的烟碱(主药)和加至100.0%的Na_(2)CO_(3)-NaHCO_(3)缓冲液(介质,pH9.0).制备烟碱固体脂质纳米粒的最佳工艺为在600bar下高压匀质法循环7次.在最优处方和最佳工艺下,制备得到的固体脂质纳米粒的平均动态光散射粒径(PCS)为452nm,其中50%颗粒的直径低于342nm,99%颗粒的直径低于850nm,多分散指数(PDI)为0.277,并且粒径在30d内无显著变化,包封率达到(12.3±4.2)%.因此,该烟碱固体脂质纳米粒杀虫剂可为研制环境友好型杀虫剂提供参考.

聚合物-脂质纳米粒用于增强酪氨酸血症I型治疗性碱基编辑器质粒的肝靶向递送研究

酪氨酸血症I型是一种罕见的常染色体隐性遗传病,目前尚无有效的治疗方法。近年来,以碱基编辑器为代表的基因编辑技术已被报道用于酪氨酸血症I型的治疗。然而,由于生理屏障的存在,碱基编辑器递送困难。在本研究中,我们构建了一种靶向去唾液酸糖蛋白受体的聚合物-脂质纳米递送系统,用于改善酪氨酸血症I型治疗性核酸药物的递送效率。我们首先合成了一种生物可降解性丙烯酸酯-氨基醇共聚物用于递送碱基编辑器质粒,其转染效率显著优于市售转染试剂Hieff Trans^(TM)。随后,共聚物纳米粒与DOPE-PEG-Gal NAc自组装形成聚合物-脂质纳米粒,用于增强纳米粒的肝脏递送效率。在体外转染实验中,包载Fah-p CMV-ABE6.3-EGFP碱基编辑器质粒的聚合物-脂质纳米粒表现出了良好的肝细胞选择性,其转染效率是游离质粒的70倍以上。研究表明,携带肝靶向配体的聚合物-脂质纳米递送系统能够有效增强治疗性碱基编辑器质粒的肝靶向递送效率并为酪氨酸血症I型的基因治疗提供了一种潜在的递送载体。

蛇床子素固体脂质纳米粒制剂的制备

目的 研究影响蛇床子素固体脂质纳米粒制备的主要因素。方法 采用熔融-匀化法制备蛇床子素固体脂质纳米粒,以正交设计法筛选较理想的处方和工艺,并考察其形态、粒径及包封率。结果 所制得的固体脂质纳米粒为圆形或卵圆形,粒子分散状态良好,无粘连,粒径分布范围100~200 nm,包封率59.78%。结论 熔融-匀化法可用于蛇床子素固体脂质纳米粒的制备。

脂质聚合物杂化纳米粒的研究进展

目的:综述脂质聚合物杂化纳米粒的最新研究进展。方法:查阅近20年国内外有关脂质聚合物杂化纳米粒文献,对脂质聚合物杂化纳米粒的制备方法、主要影响因素及其应用现状进行总结。结果:核壳结构脂质聚合物杂化纳米粒兼具脂质体与聚合物纳米粒2种载体的优势,可一定程度改善脂质体和纳米粒存在的稳定性差、药物渗漏等不足。结论:脂质聚合物杂化纳米粒是一种性能优良,具有广阔发展前景的新型给药系统,但目前尚需对稳定性、在体药效及安全性等问题做深入研究。