组织RNA聚合酶Ⅲ亚基G表达增加预测肌层浸润性膀胱癌辅助化疗反应和预后不良

目的 研究RNA聚合酶Ⅲ亚基G(POLR3G)在肌层浸润性膀胱癌(MIBC)组织中的表达及其与病人辅助化疗(ACT)反应和预后的关系。方法 2016年3月~2022年1月连续招募42例在我院就诊的MIBC病人,均采用根治性膀胱切除术治疗。使用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析MIBC临床样本中POLR3G的表达,构建组织POLR3G表达与病人临床特征的关系,分析临床结局。结果 临床队列分析发现,MIBC组织POLR3G mRNA高表达与更高的肿瘤分级和pT分期有关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,高POLR3G表达组病人的OS(中位值:9.5个月vs.25.0个月)及PFS(中位值:15.0个月vs.25.0个月)均短于低表达亚组(P<0.05)。组织POLR3G高表达是MIBC病人PFS(P=0.003)和OS(P=0.048)不良的独立预后指标,与接受ACT的POLR3G高表达的pT3/4或N_(+) MIBC病人相比,低POLR3G表达的pT3/4或N_(+) MIBC病人接受ACT后OS显著延长(P<0.001)。结论 POLR3G mRNA表达在MIBC组织中表达上调,可能是MIBC的一个潜在的预后指标,可能是预测局部进展病人辅助化疗选择的一个候选分子标志物。

DNA聚合酶Ⅲ全酶的功能和结构的发现

介绍了DNA聚合酶Ⅲ和聚合酶Ⅲ*的发现,DNA聚合酶Ⅲ全酶形式的提出以及全酶亚基的分离。同时,介绍了DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能,其中包括α核心的聚合酶功能,ε亚基的3′→5′外切核酸酶活性,β亚基滑动夹子的功能以及γ复合物的结构与功能。

甲基硫代腺苷对结肠癌RKO细胞增殖及RNA聚合酶Ⅲ依赖基因转录影响实验研究

目的:探讨甲基硫代腺苷(MTA)对结肠癌RKO细胞增殖的影响及其转录水平相关机制。方法:采用MTT比色技术及细胞计数作生存曲线的方法分析MTA对结肠癌RKO细胞增殖的影响,并采用Realtime PCR的方法分析RNA聚合酶Ⅲ依赖基因(tRNAs、5SrRNA)。结果:0.5、1、2、3mmol/L MTA作用16h后,RKO细胞的增殖能力分别为对照组的(84.1±4.5)%、(69.4±5.2)%、(55.3±3.8)%、(40.9±3.5)%(P均<0.01);MTA 0.5mmol/L作用4、8h后,RKO细胞tRNAs、5SrRNA的转录水平分别为对照组的0.584±0.033、0.624±0.035,0.453±0.025、0.372±0.027(P均﹤0.01)。结论:MTA对RKO细胞具有明显的抗肿瘤活性,且对RNA聚合酶Ⅲ依赖基因转录的下调可能起到重要作用。

Maf1:一种RNA聚合酶Ⅲ的负调节因子

Maf1是一种RNA聚合酶Ⅲ的负调节因子,在酵母雷帕霉素诱导的营养限制、DNA损伤和分泌通路缺陷反应过程中发挥重要作用。在不利生长条件下,Maf1被蛋白磷酸酶2A脱磷酸化而激活,被运输到细胞核发挥对RNA聚合酶Ⅲ的抑制作用。Maf1还可以被蛋白激酶A磷酸化并在Msn5载体蛋白的协助下运出细胞核而解除抑制。Maf1在真核生物中高度保守,因此相关研究在理解哺乳动物RNA聚合酶Ⅲ转录抑制机理方面可能有重要意义。

抗RNA聚合酶Ⅲ抗体阳性率及CD4^+、CD8^+T细胞水平检测对系统性硬化症诊断的临床研究

目的:研究抗RNA聚合酶Ⅲ抗体(Anti-RNApolymeraseamibodies,ARA)和T淋巴细胞亚群检测对系统性硬化症(Systemicsderoderma,SSc)诊断的临床意义.方法:选择荷泽市立医院收治的SSc患者80例作为研究对象,根据患者病情是否处于活动期分为活动组40例(SSc活动期)和稳定组40例(SSc稳定期),另选择同期到菏泽市立医院进行健康体检者50例作为对照组,三组均接受自身抗体检测[采用免疫印迹法和间接免疫荧光法对ARA进行测定]和T淋巴细胞亚群检测(采用流式细胞未对外周血CD4^+T、CD8^+T细胞百分率及CD4^+T/CD8^+T比值进行检测),统计并比较三组ARA阳性率、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞百分率及CD4^+ T/CD8^+T比值,分析ARA与SSc患者重要脏器受累的关系、ARA与SSc患者疾病进程及严重程度的关系。结果:活动组ARA阳性奉15.00%(6/40)、稳定组ARA阳性率10.00%(4/40)均高于对照组的0.00%(0/40)(P<0.05);活动组CD4^+T细胞百分率、CD8^+T/CD8^+T比值均高于稳定组和对照组,CD8^+T细胞百分率则低于稳定组和对照组(P<0.05);稳定组CD4^+T细胞百分率、CD4^+T/CD8^+T比值高于对照组,CD8^+T细胞百分率则低于对照组(P<0.05);ARA阳性者与ARA阴性者的肺间质病变情况、心脏受累情况、肾脏受累情况以及金清肌酐和尿素氮水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)结论:抗RNA聚合酶ID抗体以及T淋巴细胞亚群水乎检测对SSc的临床诊断均具有较高的价值,其中抗RNA聚合酶Ⅲ抗体与弥散性硬化症患者内脏受累密切相关,CD4^+T细胞、CD8^+T细胞所占比例则与SSc的临床活动度密切相关.

酒精诱发乳腺癌过程中RNA聚合酶Ⅲ依赖基因转录与雌激素受体α表达的关系

目的探讨酒精诱发乳腺癌的分子机制。方法采用RealtimePCR方法分析酒精对雌激素受体d（ERd）不同表达状况的乳腺细胞系、酒精联合雌激素MCF-7细胞系以及酒精对转染EROcsiRNA的MCF-7细胞系的RNA聚合酶Ⅲ依赖基因（tRNAs、5SrRNA）的转录水平。结果酒精对ER＋乳腺细胞系tRNAs、5SrRNA上调水平（7～8倍）明显高于ER-乳腺细胞系（2～3倍）（P〈0．01）；酒精和雌激素联合处理对MCF-7细胞系tR-NAs、5SrRNA的转录水平的上调作用（12-14倍）明显高于酒精（7～8倍）或雌激素（2—3倍）单独作用组（P〈0．01）；酒精对转柒ERdsiRNA组MCF-7细胞系（2～3倍）tRNAs、5SrRNA的转录水平的上调作用明显低于未转染组（6～8倍）（P〈0．01）。结论酒精诱发乳腺癌过程中RNA聚合酶Ⅲ依赖基因转录水平的上调依赖于ERa的表达。

生物化学教材中E.coli DNA聚合酶Ⅲ的组成和结构变化

所有生物化学教材均把大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)DNA聚合酶Ⅲ当做DNA复制的模式分子介绍,但新的研究结果发现,最新探索的E.coli DNA聚合酶Ⅲ的结构与原来描述的结构已有很大的不同。我国目前的生物化学教材对E.coli DNA聚合酶Ⅲ的结果描述仍旧采用旧的模型,已经落后于新的研究发现,需要及时更新。为促进我国生物化学教材建设,本文介绍了新版国际生物化学教材《Lehninger Principles of Biochemistry》描述的E.coli DNA聚合酶Ⅲ结构,以供教学交流。

骨肉瘤血清标志蛋白筛选及对RNA聚合酶Ⅲ多肽F的初步生物信息学分析

目的筛选潜在的骨肉瘤血清蛋白标志物，对候选标志基因RNA聚合酶Ⅲ多肽F（POLR3F）进行初步生物信息学分析。方法分别利用人类基因组芯片和表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOFMS）筛选骨肉瘤细胞株以及骨肉瘤患者血清中差异表达的基因和标志蛋白。运用Link—test统计学方法对比基因：巷片和SELDI—TOFMS数据，寻找骨肉瘤的血清诊断标志蛋白。用MATLAB软件对POLR3F的启动子和3’-UTR区域进行生物信息学分析，寻找转录因子和微小RNA（miRNA）靶位点。结果与对照组相比，有653个基因在骨肉瘤细胞中的表达差异倍数在2倍以上。SELDI—TOFMS显示，在骨肉瘤患者血清中有6个差异表达的质谱峰。通过Link-test分析，共鉴定出13个差异表达的骨肉瘤血清标志蛋白。POLR3F的启动子区存在保守的信号转导和转录激活因子3（STAT3）结合位点，在3’-UTR保守区域含有1个miRNA靶位点。结论Link-test能够有效地从转录组和蛋白质组数据中筛选骨肉瘤标志蛋白。POLR3F有可能成为骨肉瘤早期诊断的标志蛋白和骨肉瘤治疗的新靶点。

依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ与基因表达和基因治疗

依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ (polⅢ )能催化 5SrRNA、tRNA、U6SnRNA等一些小的、稳定的RNA的合成。文章综述了依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅲ的启动子和转录复合物 ,并介绍了RNA聚合酶Ⅲ的转录在基因表达和基因治疗 (核酶、反义核酸、RNA干扰技术等 )研究中的应用价值。

水牛RNA聚合酶III启动子的克隆与鉴定

【目的】获得有效的水牛RNA聚合酶III启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础。【方法】通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段(shEGFP)对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况。【结果】克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357bp,其OCT-1(或CACCC盒)及TATA盒高度保守。连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82%和87.45%;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组(P<0.05),而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著(P>0.05)。【结论】水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性。

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。

真核生物RNA聚合酶的结构和功能概述

真核生物中存在三种RNA聚合酶,它们对基因的表达起着十分重要的作用。本文概述三种RNA聚合酶的结构和功能。

5-甲基硫代腺苷对结肠癌Hct116细胞增殖的影响

目的研究5-甲基硫代腺苷(MTA)对结肠癌Hct116细胞增殖的影响及其相关机制。方法采用MTT比色法及软琼脂克隆形成试验分析MTA对结肠癌Hct116细胞增殖的影响,采用Realtime PCR的方法分析RNA聚合酶Ⅲ依赖基因(tRNAs、5S rRNA)及TFⅢB亚单位TBP、Bdp1和Brf1基因mRNA水平的变化,并采用Western Blot的方法分析了TFⅢB亚单位Bdp1蛋白水平的变化。结果 MTA对结肠癌Hct116细胞具有明显的增殖抑制作用,在这一过程中,RNA聚合酶Ⅲ依赖基因(tRNAs、5S rRNA)的mRNA水平明显下调;同时TFⅢB亚单位Bdp1在mRNA水平和蛋白水平也出现了明显下调。结论 MTA对结肠癌Hct116细胞具有明显增殖抑制作用;RNA聚合酶Ⅲ依赖基因转录的下调、TFⅢB亚单位Bdp1蛋白的下调可能在这一抗肿瘤过程中起到重要作用。

RNA干扰分子的制作

小干扰RNA是一种能够在各种生物体和细胞(包括蠕虫、果蝇、植物、哺乳动物)中减弱基因表达的有效工具。在哺乳动物中转染的siRNA能够抑制特殊基因的表达,这已经证明是探索基因功能、基因敲除、抗病毒研究、基因治疗的有效方法。简单、有效、特异性地抑制基因的表达具有巨大的科学、商业和医学治疗价值。如何设计和制作siRNA是影响RNA干扰效率的一个很重要的方面。本文就siRNA的设计和制作等方面作扼要的介绍。

RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU对PKR磷酸化的调节作用

目的研究ALU自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子对RNA聚合酶Ⅱ转录的影响,探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU对PKR磷酸化的调节作用。方法将ALU全基因序列插入pcDNA3.1(-)载体的CMV启动子(一个RNA聚合酶Ⅱ启动子)的下游,构建重组质粒pcDNA3.1-ALU;转染HEK293细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR筛选稳定表达ALU的细胞;用干扰素处理稳定表达ALU序列的细胞,Western blot法检测PKR的磷酸化水平。结果ALU全基因序列插入pcDNA3.1载体的CMV启动子直接下游,能够被RNA聚合酶Ⅱ有效转录;在稳定表达ALU的HEK293细胞中,加干扰素与未加干扰素组PKR的磷酸化水平均明显高于相应的HEK293细胞对照组。结论ALU自身的RNA聚合酶Ⅲ启动子对RNA聚合酶Ⅱ转录无明显影响,但与RNA聚合酶Ⅲ启动下转录的ALU不同,RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU失去了对干扰素的拮抗作用,反而可以通过形成双链RNA的方式激活PKR的活性。

RNA干扰的实现及应用前景

RNA干扰现象是生物界的一种保守行为,能特异性地抑制同源基因表达,具有维持基因组稳定性和抵抗病毒入侵的作用。RNA干扰现象已在植物、真菌、低等无脊椎动物和哺乳动物等多种生物体内发现,其可能是生物界一种古老而且进化上高度保守的重要现象。RNA干扰是生物体适应外界环境、基因表达调控、抵抗外源病毒RNA侵染而保护基因组的重要机制。本文综述了RNA干扰的原理、实现方法、应用等几个方面的研究,并对RNA干扰在基因治疗上的应用前景进行了展望。

DNA识别受体的研究进展

作为生命物质基础的DNA主要通过内体TLR9和胞质识别受体来启动免疫应答。近年来TLR9受体研究的新进展主要体现在以下四个方面:(1)TLR9与其配体相互作用的决定因素;(2)TLR9由内质网到内体的转位机制及其重要性;(3)内体的酸化成熟和TLR9的剪切在信号转导中的作用;(4)TLR9区分自体与外源DNA的可能机制。同时,有关TLR9拮抗剂和TLR9缺陷小鼠的一系列实验有力地证实了TLR9非依赖性胞质DNA受体的存在,到目前为止共发现了3个分子:DAI、AIM2、RNA聚合酶Ⅲ。

BRF2基因及在肺癌中的作用研究进展

肺癌位居恶性肿瘤发病率第一位,是威胁人类健康的重大疾病。BRF2基因位于染色体8p12位置,参与RNA聚合酶Ⅲ催化小分子RNA生成。BRF2基因与RNA聚合酶Ⅲ之间的关系决定了BRF2在肿瘤发生发展过程中存在重要作用。研究发现BRF2在非小细胞肺癌中过度表达,同时作为癌基因,保护癌细胞免受氧化应激的影响,并在上皮间充质转化中促进了肿瘤细胞的转移与扩散。通过研究,希望将BRF2作为靶点实现对非小细胞肺癌更精准的诊断及治疗。