产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌聚合酶交联螺旋反应快速检测方法的建立

为建立一种快速检测产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌(emetic Bacillus cereus)的新型、敏感且可视化的聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)方法,本实验根据该菌结构性合成酶基因cesB设计特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,初步建立了检测emetic B.cereus的PCLSR方法。结果显示,PCLSR方法在64℃反应50 min、dNTP浓度为0.3 mol/L、Bst聚合酶浓度为8 U/管时获得最佳扩增效果。以5株emetic B.cereus和12株临床常见菌的DNA作为模板,经本研究建立的该PCLSR方法检测,结果显示,PCLSR法能有效检测5株emetic B.cereus,而对其他相关细菌的检测结果均为阴性,表明该方法特异性较强。将emetic B.cereus 10倍倍比稀释(1×10^(7)cfu/mL~1×10^(0)cfu/mL)后采用该PCLSR法、LAMP法和荧光定量PCR(qPCR)方法检测,结果显示,PCLSR法和qPCR方法的检测限均达1×10^(2)cfu/mL,LAMP法的检测限为1×10^(3)cfu/mL,表明本研究建立的PCLSR法的敏感性较高。采用“国标”中的细菌培养法、PCLSR法、qPCR法及环介导等温扩增(LAMP)法同时检测50份人工污染emetic B.cereus的饲料及灭菌牛奶样品,结果显示,PCLSR法与qPCR法检测emetic B.cereus的阳性率为30%(15/50),阴性率为70%(35/50),二者的符合率均达100%;细菌培养法和LAMP法检测emetic B.cereus的阳性率为24%(12/50),阴性率为76%(38/50),二者与PCLSR法的总符合率均为80%。综上所述,本研究建立的PCLSR法具有较强的特异性、较高的敏感性,且不需要复杂设备和昂贵试剂即可在短时间内完成对emetic B.cereus的检测,该方法的建立为基层部门对emetic B.cereus的检测及该菌的流行病学调查提供了新的技术手段。

基于可视化聚合酶交联螺旋反应快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)的新型可视化方法,本研究以S.aureus耐热核酸酶基因(nuc)为靶序列设计特异性引物,对其反应条件进行优化,建立聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)可视化检测方法,结果显示,PCLSR法在反应温度62℃,孵育时间60 min、dNTPs浓度为3.0 mmol/L、Bst-DNA聚合酶浓度为10 U/管时扩增效果最佳。提取14株金黄色葡萄球菌和9株非金黄色葡萄球菌基因组为模板,利用该方法进行特异性试验,结果显示,PCLSR法能有效检测到14株S.aureus,而对其他9株非S.aureus检测结果均为阴性,特异性良好。10倍倍比稀释S.aureus菌液(1×10^(7)cfu/m L~1×10^(0)cfu/m L)后提取基因组作为模板,进行敏感性试验,结果显示,PCLSR法与荧光定量PCR法具有相同的敏感性,检测下限均达到1×10^(2)cfu/m L,而环介导等温扩增(LAMP)敏感性为1×10^(3)cfu/m L,可见该PCLSR敏感性较高。利用该PCLSR、LAMP、细菌培养法和荧光定量PCR法同时检测46份人工污染的生猪肉、灭菌纯牛奶样品中金黄色葡萄球菌,以评价该方法的检测性能,结果显示,PCLSR与荧光定量PCR检测结果与样品符合率为100%,而细菌培养法和LAMP法与样品的符合率仅均为91.67%,可见该PCLSR可以用于临床样品的检测。本研究为动物疾病预防和食品卫生检验等领域快速检测S.aureus提供了新型检测方法。