聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法对太白贝母鉴别检验的适用性探讨

目的:探讨聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)对于太白贝母的适用性。方法:采集太白贝母野生及栽培品,收集市场上太白贝母伪品,利用性状、PCR-RFLP鉴别法、DNA序列分析三种方法分析太白贝母与常见伪品的区别。结果:从性状上看,太白贝母栽培品与伪品往往非常相似,较难辨别;通过PCRRFLP方法可以正确、客观的鉴别太白贝母与常见伪品,基于ITS2的DNA条形码方法进一步验证了PCR-RFLP法的准确性。市场上太白贝母的伪品多为伊犁贝母。结论:PCR-RFLP鉴别法可准确鉴别太白贝母与其伪品;市场上太白贝母伪品较多,应加强监管。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性和芯片生物分析技术用于渤海地区鱼种鉴定

以渤海湾具有重要商业价值的9种海鱼(小黄鱼、花鲈、蓝点马鲛、鲐、钝吻黄盖鲽、棘头梅童鱼、许氏平鲉、高眼鲽和长蛇鲻)为研究对象,利用聚合酶链式反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)和芯片生物分析技术对其进行鱼种鉴定。首先提取其基因组脱氧核糖核酸(DNA),对其细胞色素b的特定片段(464bp)进行扩增,然后选择DdeⅠ、HaeⅢ和NlaⅢ3种限制性内切酶进行酶切,并利用芯片生物分析技术得到酶切产物的特异图谱和确切的片段大小,从而有效区分了9种海鱼。研究结果表明,PCR-RFLP和芯片生物分析技术在鱼种鉴定上具有精确、鉴别和快速三大优势,可为鱼类食品检测提供科学依据。

双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

逆转录—聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性分析对我国肾综合征出血热病毒分型的研究

建立准确、快速、灵敏的汉坦病毒基因分型方法，可弥补传统血清学方法的不足，对防治该病毒所致的肾综合征出血热（HFRS）具有重要意义。本试验采用逆转录－聚合酶反应（RT－PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）和限制性片段长度多态性（RFLP）方法，对流行于我国的两型汉坦病毒代表株－汉滩型（HTNV）76－118 和汉城型（SEOV）R22株进行基因分析。根据病毒DNA序列的电脑软件分析。不同HFRSV囊膜糖蛋白编码基因M节段1199－1497间核苷酸序列上RsaI,TaqI和HindⅢ的酶切位点存在差异（Fig.I),可用于进行限制性内切酶基因多态性分析，以确定HFRV的型别。首先，以一对引物扩增该片段（Fig.2)。然后，分析用这三种内切酶（Fig.3,4,5)进行酶切分型，共分析了从我国不同地区，不同宿主分离的毒株18株，及国际标准毒株2株，酶切图谱显示，这些毒株可以被分为三组（Table.a)：9株可定为HTNV型，8株可定为SEOV型，3株无法确定其型别（X型），该法分型结构与血清学经典的空斑减数中和试验分型结构基本一致，说明该酶切分型方法具有一定的可行性。

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法用于检定川贝母掺伪情况的研究

目的:探讨聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法在检定川贝母掺伪中的应用。方法:将川贝母药材DNA与伊贝母药材DNA按不同比例混合,进行PCR扩增,限制性内切酶SmaI作用及琼脂糖凝胶电泳。通过这些实验,可以知道混合样品中伪品的检出限。接着,为了探究本实验中条带灰度与掺伪比例之间的关系,用Image J软件分析凝胶电泳图上的条带,根据未切割条带与切割条带的灰度比,得到标准化值。通过标准化值和掺伪比例2个参数,得到标准曲线,并进行准确性验证。结果:低至0.5%的掺伪比例即可通过该方法被检测。随着掺伪比例增加,未切割条带逐渐增强,切割条带逐渐减弱,两者条带的灰度比值也逐渐增加,到掺伪50%时,几乎没有肉眼可见的切割条带。根据不同掺伪比例对应的标准化值做出标准曲线,经验证该标准曲线的误差率约为0.94%。结论:PCR-RFLP法用于川贝母掺伪检测的检出限为0.5%,灵敏度高;且可通过条带灰度定量的方法反应掺伪比例大小。本研究为改变川贝母PCR-RFLP检验的取样方式和确定取样量提供了实验依据。

两种白茅根聚合酶链式反应法-限制性片段长度多态性分析鉴别方法的研究

目的从分子水平鉴别2种不同性状的白茅根。方法采用植物通用DNA条形码ITS1、ITS2、psb A-trnH、rbc L和mat K对30份白茅根样品的序列进行比较研究,分析2种不同性状白茅根的多个位点差异。结果 30批白茅根的psb A-trnH、rbc L和mat K基因序列无位点差异,ITS1序列含3个关键差异位点,ITS2序列含1个关键差异位点,且ITS2序列上的关键差异位点可被限制性内切酶Hpy CH4Ⅲ识别。结论 ITS1和ITS2序列可作为2种不同性状白茅根鉴别用的DNA条形码序列,且利用ITS2序列上可被限制性内切酶Hpy CH4Ⅲ识别的关键差异位点可建立2种不同性状白茅根的PCR-PFLP鉴别方法。

HSP70-hom基因多态性与高原反应易感性的关系

目的 探讨热应激或热休克蛋白 70 hom (HSP70 hom)基因型与高原反应易感性间的关系 ,为发现和保护易感人群提供依据。方法 随机选取武警战士 2 2 9人 ,其中 5 6人有高原反应者为病例组 ,173人无高原反应者为对照组。应用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)分析方法 ,研究两组观察对象中HSP70 hom的基因型分布情况。结果 病例组HSP70 homA/A基因型的频率明显高于对照组 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论 HSP70 homA/A基因型的机体可能存在应激能力较弱的问题 ,这有助于在特定职业人群中发现和保护这些个体 ,为保障健康 。

中国人群醛固酮合成酶基因T-344C位点单核苷酸多态性频率分析

目的研究醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C单核苷酸多态性(SNP)在中国人群中的分布。方法采用PCR-RFLP法对中国人群进行醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率分析比较。结果中国人群的醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C基因型频率分布:TT型占64.5%,TC型占30.8%,CC型占4.7%;等位基因频率T占79.9%,C占20.1%。各基因型频率、等位基因频率与西班牙人、德国人、苏格兰人、日本人差异非常显著。结论醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率的分布有明显的种族差异。

α_1-抗糜蛋白酶基因多态性与阿尔茨海默病相关性探讨

目的 :探讨阿尔茨海默病 (AlzheimerDisease,AD)患者中α1 抗糜蛋白酶 (AACT)基因的多态性及其与AD的相关性。方法 :利用聚合酶链反应 (PCR) 限制性片段长度多态性 (RFLP)技术 ,对 4 8例AD患者及 86例对照者的AACT信号肽基因进行分型 ,并进行AD与AACT信号肽基因多态性的相关分析。结果 :①AD病人AACT信号肽A/T基因型占 2 7 1% ,明显低于对照组的 5 1 2 % (P <0 0 1,RR =0 35 5 ) ,T/T占 6 0 4 % ,明显高于对照组的 37 2 % (P <0 0 1,RR =2 5 76 ) ,A/A占 12 5 % ,与对照组 11 6 %无显著性差异 (P >0 0 5 ,RR =1 0 86 )。②AD病人中AACT信号肽等位基因A的频率为 2 6 0 % ,T的频率为 74 0 % ,与对照组 (A37 2 %、T 6 2 8% )无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 :AD病人的AACT T/T可能与AD存在正相关 ;而AACT

肿瘤坏死因子α基因(TNFα)-G308A多态性与精神分裂症的关联

目的 :探讨肿瘤坏死因子α基因 (TNFα) -G3 0 8A多态性与精神分裂症的关系。方法 :收集14 1个核心家系 ,每家有 1名符合ICD -10精神分裂症诊断标准的患者 ,患者的生物学父母均健在 ;用聚合酶链式反应 -限制性片段长度多态性 (PCR -basedRFLP)分析方法检测所有研究对象的TNFα -G3 0 8A基因型。结果 :传递不平衡检验 (TDT)显示等位基因的传递具有统计学显著性差异 ( χ2TDT=7 70 44 ,P =0 0 0 5 )。结论 :肿瘤坏死因子α基因 (TNFα) -G3 0 8A多态性与精神分裂症相关联 ,支持肿瘤坏死因子α基因(TNFα)是精神分裂症的候选基因。

AT1R 1166A/C和CYP11B2-344C/T基因多态性与湖南汉族原发性高血压的相关性

目的探讨血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)1166A/C和醛固酮合酶(CYP11B2)-344T/C基因多态性与原发性高血压(EH)的相关性。方法用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)对100例EH患者和100例体检健康者AT1R1166A/C和CYP11B2-344T/C基因多态性进行检测。结果 EH组AT1R 1166A/C AC型和C等位基因的频率高于健康对照组;AC基因型的血压值、TG,TC,LDL-C均明显高于AA基因型。HDL-C低于AA型CYP11B2各基因型频率和等位基因频率无显著性差异(P>0.05)。各组内等位基因T的频率高于等位基因C(P<0.05)。两基因联合分析显示,相对于AA-TT联合基因型,同时携带AC-CT联合基因型的人群患高血压的危险性增加了2.25倍。结论 AT1R 1166A/C多态性与EH易感性相关,CYP11B2-344T/C基因多态性与EH无关,携带AT1R 1166A C型基因以及AC-CT联合基因型的人群患高血压的危险性大。

药物代谢酶CYP3A在中国肾移植人群的遗传多态性

目的:建立药物代谢酶CYP3A4、CYP3A5的多个等位基因分型方法,为进一步从基因水平研究CYP3A与机 体对药物反应的个体差异本质及其与药物代谢的相关性提供分子生物学实验方法;探讨药物代谢酶CYP3A在中 国肾移植人群的遗传多态性。 方法:用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性(PCR RFLP)法及特异性等位基因 扩增(PCR ASA)法分别建立了CYP3A的CYP3A4亚型三个新突变点(CYP3A4 4、 5、 6)及CYP3A5亚型的 CYP3A5 3基因分型方法,并对中国肾移植人群进行基因分型。 结果:CYP3A4 4、 5、 6、CYP3A5 3在中 国肾移植人群的基因频率分别为0.75%、0.76%、0.75%和27.83%;个体突变率分别为2/133、3/197、3/200和 55/115。 结论:研究结果提示,中国肾移植人群中CYP3A4 4、 5、 6、CYP3A5 3的存在可能使其表达的药 物代谢酶活性改变,从而影响药物在体内的代谢过程。

IL-10-1082位点单核苷酸多态性与我国胃癌的关系

目的研究白细胞介素10(IL-10)基因-1082位点单核苷酸多态性在我国胃癌高发区和低发区普通人群和胃癌患者中的分布,并探讨该位点基因多态性与我国胃癌的关系。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测年龄和性别匹配的广东省104例普通人群及104例胃癌患者和陕西省普通人群和胃癌患者各102例的IL-10-1082位点单核苷酸多态性。采用ELISA检测血清幽门螺杆菌(Hp)IgG。结果IL-10-1082位点A/A、A/G、G/G三种基因型在本研究人群中的分布频率为86.7%、10.7%和2.4%。在胃癌低发区,胃癌患者携带IL-10-1082G*的频率明显高于普通人群(14.4%vs7.7%,χ2=4.02,P<0.05,OR=1.01,95%CI=1.08～3.10),IL-10-1082G*基因型增加Hp感染后胃癌发生的危险性(χ2=5.36,P<0.05,OR=6.0,95%CI=1.23～17.52);在胃癌高发区,胃癌患者IL-10-1082G*基因型频率与对照组无明显差异(12.7%vs16.6%,P>0.05)。两地区胃癌人群IL-10-1082G*基因型频率无显著差异(12.7%vs14.4%,χ2=0.13,P>0.05);两地区普通人群中,高发区IL-10-1082G*基因型频率明显高于低发区(16.6%vs7.7%,χ2=4.27,P<0.05,OR=1.29,95%CI=1.12～6.11)。结论IL-10-1082G等位基因增加Hp感染后胃癌发生的危险性,IL-10-1082位点单核苷酸多态性可能与我国汉族人群胃癌发生有关。

PCR-RFLP检测载脂蛋白CⅢ基因T-455C多态性方法的建立及应用

目的建立聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测载脂蛋白CⅢ(apoCⅢ)T-455C多态性的方法,探讨南通汉族人群中apoCⅢ多态性与高三酰甘油血症(HTG)的相关性。方法用PCR扩增apoCⅢ基因启动子区包含T-455C多态性在内的DNA片段,扩增产物用限制性内切酶BseGⅠ酶切后电泳,分析apoCⅢ基因型,同时采用生化方法检测研究对象的血脂和载脂蛋白水平。结果检测到3种基因型,分别为-455TT、-455TC和-455CC。HTG患者组和健康对照组apoCⅢ-455C等位基因频率(50.44%比33.11%)和apoCⅢ-455CC基因型频率(26.55%比12.16%)均有显著差异(P<0.01);C等位基因携带者患HTG的风险是非携带者的2.06倍(95%CI:1.31～3.24);-455C等位基因携带者有较高的三酰甘油(TG)和apoCⅢ蛋白水平(P<0.05)。结论PCR-RFLP是一种快速、敏感的分析apoCⅢ基因启动子区T-455C多态性的方法;apoCⅢ-455C等位基因与HTG的发生相关。

肿瘤坏死因子-α基因多态性与支气管哮喘相关性研究

目的 探讨肿瘤坏死因子 -α(TNF-α) - 30 8基因多态性与中国汉族支气管哮喘 (BA)易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (PCR- RFL P)方法 ,检测 6 4例 BA患者及 80例健康对照者的TNF-α- 30 8基因多态性 ,用 L ogistic回归计算其比值比 (OR)及 95 %可信区间 (95 % CI)。结果 TNF-α- 30 8A等位基因在 BA组及对照组的频率分别为 2 0 .31%、8.75 % ,两组比较有显著性差异 ;OR值为 2 .389,95 % CI为1.14 8～ 5 .6 38。结论 TNF- α- 30 8基因多态性与中国汉族 BA易感性有关。

E-选择素基因多态性及血清可溶性水平与慢性HBV感染临床结局的关系

目的:探讨E-选择素(E-selectin)基因第2号外显子G98T和第4号外显子A561C多态性及血清可溶性水平与慢性HBV感染临床结局之间的关系.方法:从外周血中提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测367例慢性HBV感染者(其中慢性HBV携带者97例,慢性乙肝101例,肝硬化121例,肝癌48例)和281例健康对照者E-选择素基因G98T和A561C位点多态性,同时采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组可溶性E-选择素(sE-选择素)水平.结果:E-选择素A561C多态性中A/C+C/C基因型和C等位基因频率在肝硬化组与对照组相比差异有统计学意义(P=0.006,0.002).A/C+C/C基因型患肝硬化的风险是AA基因型的2.45倍(OR=2.45,95%CI:1.28-4.72).E-选择素G98T多态性中各基因型频率和等位基因频率在各病例组与对照组相比差异无统计学意义,但在肝硬化患者中,Child-pughB+C级与A级相比较,G/T+T/T基因型频率差异有统计学意义(P=0.034),G/T+T/T基因型发展到Child-pughB或C的风险是GG型的3.07倍(OR=3.07,95%CI:1.05-8.97).慢性乙肝组和肝硬化组血清sE-选择素水平明显高于对照组(P<0.01);在肝硬化组中,血清sE-选择素水平从Child-pughA级到C级明显降低(P<0.05);在各组中,C等位基因携带者血清sE-选择素水平明显高于A等位基因携带者(P<0.05).结论:E-选择素A561C基因多态性可能与慢性HBV感染后肝硬化的发生相关,并参与调控血清可溶性E-选择素的表达;E-选择素G98T基因多态性与慢性HBV感染后的临床结局无相关性,但可能与肝硬化的严重程度相关.

重型抑郁症患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测

目的探讨北方汉族人群5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与重型抑郁症的关系。方法采用病例-对照研究。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测MTHFRC677T及A1298C基因多态性。结果 (1)对照组677TT基因型频率及T等位基因频率分别为13.16%和39.80%;1298CC基因型和C等位基因频率分别为1.32%和12.83%;(2)抑郁症组MTHFR677TT基因型频率(35.53%)明显高于正常对照组(13.16%)(P<0.001),677 T等位基因频率(57.24%)明显高于对照组(39.80%)(P<0.001)。(3)Logistic回归分析,C677T基因型与疾病的发生有关(P<0.001)。结论 MTHFRC677T基因变异与本组重症抑郁症发病有关,是其发病的危险因素;MTHFRA1298C基因变异与本组重症抑郁症发病无关联。

线粒体ATPase-6基因多态性与男性精子活力的关系

目的探讨线粒体ATP合成酶6亚基(ATPase-6)基因多态性与男性精子活力的关系。方法选择弱精子症患者319例(观察组)及精子活力正常者344例(对照组),采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析技术检测其线粒体ATPase-6基因(+9 052 bp)的HaeⅡ酶切位点多态性,并对两组的基因型分布及等位基因频率进行Hardy-Weinberg平衡检测,分析ATPase-6突变基因频率与精子活力的关系。结果观察组的hh、Hh、HH基因型分布分别为19.74%、1.25%、79.01%,对照组分别为4.94%、0.58%、94.45%,两组基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡范围;但观察组的突变型基因(h)频率明显高于对照组(P<0.01)。结论 ATPase-6基因(+9 052bp)HaeⅡ酶切位点突变可能影响ATPase-6基因的翻译效率,进而影响男性精子活力,引起弱精子症。