牛支原体可视化重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增(LFD-RPA)临床诊断方法,以牛支原体uvrc基因序列为靶基因,设计特异性引物和探针,通过筛选引物和探针、优化反应条件,并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进行验证。结果显示,该试验建立的牛支原体LFD-RPA最佳引物为F2/R2,最佳反应条件为39℃、 25 min;检测灵敏度可达2.08 copies·μL^(-1),是普通PCR灵敏度的100倍;与滑液囊支原体、沙门氏菌、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌之间无交叉反应;重复性稳定;对50份鼻拭子样本进行检测,阳性率为26%,与我国行业标准PCR检测方法的符合率为89.6%。该试验成功建立了牛支原体LFD-RPA检测方法,该方法具有操作简便、快速、高效、敏感等优点,为牛支原体的临床快速诊断提供了技术支撑。

基于重组酶聚合酶扩增技术的牛源性成分快速检测方法

市场中肉类食品掺假的复杂多样化使得监管机构对动物源性成分鉴定的便捷性、准确性、灵敏性要求越来越高。尤其是市场上经济价值较高的牛肉类产品已成为制假的重灾区,迫切需要建立一种快速、高效的牛源性成分分子检测方法。基于此,以牛组成型表达基因β-actin为靶基因设计并筛选了几组牛特异性扩增的引物和探针组合,经过灵敏度检测和特异性验证,建立了一种牛源性成分实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)快速检测方法。通过优化试剂配比,提高了一步法提取牛肉制品DNA的效率,同时将PRA技术与胶体金免疫试纸条显色技术相结合实现了检测的便捷化和结果的可视化。实际应用结果表明,研究建立的牛源性RPA检测方法能够特异性地检测牛源性成分,且最低检测灵敏度可达到14.8个拷贝,通过胶体金免疫试纸条得到的可视化结果的准确性和灵敏度与实时荧光RPA相同。该方法特异性强、灵敏度高,整个过程在25 min内即可完成,极大缩短了检测时间。

重组酶聚合酶扩增技术在动物病原菌检测中的应用进展

体外核酸扩增技术在动物疫病病原检测中应用广泛。重组酶聚合酶扩增(RPA)作为一种新型的核酸等温扩增技术,可在较低温度(37~42℃)下扩增DNA或RNA,具有反应时间短、样品制备量少、特异性和敏感性高等优点。RPA突破了常规聚合酶链反应(PCR)实施时对实验室条件的依赖性,并能高效和灵敏地检测动物疫病病原。基于RPA技术的病原菌检测方法可实现对动物细菌病的现场快速诊断。论文综述了RPA技术的反应体系和条件、反应原理和产物检测方法等,介绍了RPA技术在动物病原菌检测中的应用和潜在价值,以期为动物疾病快速诊断研究提供参考。

重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。

重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。

基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术的铜绿假单胞菌快速检测方法的建立

目的 针对铜绿假单胞菌毒力基因exoS,建立一种实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)技术检测方法,并评价该方法的特异性、灵敏度及实用性。方法 根据铜绿假单胞菌毒力基因exoS的特异性保守区域,设计RPA特异性引物和探针,对提取的目标DNA进行检测,确定RPA方法的特异性和灵敏度;建立实时荧光定量PCR(qPCR)法,对目标DNA进行检测,比对不同检测方法对铜绿假单胞菌的检出限;通过临床样本性能验证试验,进一步确定RPA技术检测铜绿假单胞菌的可行性。结果 建立的RPA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有特异扩增曲线,对其他细菌无特异扩增曲线;RPA方法检测病原菌的灵敏度为5×10^(2) cfu/mL,该方法与qPCR法检出限一致且结果可靠;RPA方法检测时间仅需30 min,明显短于传统方法的检测时间。结论 该研究建立的铜绿假单胞菌RPA检测方法特异性强、灵敏度高,相对于传统检测方法明显缩短检测时间,可用于临床标本中铜绿假单胞菌的快速检测。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

铜绿假单胞菌重组酶聚合酶扩增检测方法研究

基于铜绿假单胞菌中高度保守的外毒素A基因设计特异性引物,建立并优化重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)条件,并评价该方法的灵敏度和抗干扰能力。结果显示,RPA反应体系能够在40℃等温条件下,20 min内实现对目标基因的扩增,检出铜绿假单胞菌的灵敏度为10~2 CFU·mL^(-1),抗干扰能力与GB 8538-2022相一致。经培养优化后,铜绿假单胞菌的最低检出限可达10 CFU·mL^(-1),且重复性良好。本研究探索的铜绿假单胞菌RPA扩增检测方法操作简单、反应迅速、抗干扰能力强,为食品中铜绿假单胞菌的快速识别提供了新的方向与参考。

山羊支原体山羊肺炎亚种重组酶聚合酶扩增技术的建立

为检测山羊传染性胸膜肺炎,选择Mccp-arcA假基因作为靶基因,用Primer 3 plus设计筛选生物素标记的特异引物和荧光素标记的探针,将双标记扩增产物结合到核酸检测试纸条,通过优化反应温度和时间,建立了一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的重组酶聚合酶扩增技术,对其灵敏度、重复性、准确性和特异性进行了试验,并初步用于临床样品的检测。结果显示,山羊传染性胸膜肺炎核酸阳性样品能够在核酸检测试纸条上显示阳性条带,阴性样品无条带。试验具有良好的重复性和敏感性(达到10 copies/μL)。用建立的重组酶聚合酶扩增技术与普通PCR方法同时检测疑似山羊传染性胸膜肺炎8份样品,结果均为3份阳性和5份阴性,符合率100%。该检测方法适用于山羊传染性胸膜肺炎的快速诊断,为Mccp的快速检测提供了新的技术。

重组酶聚合酶扩增技术用于脑脊液中肺炎链球菌检测的价值

目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)技术用于脑脊液(CSF)中肺炎链球菌检测的价值。方法利用RPA技术检测CSF中肺炎链球菌。根据肺炎链球菌LepA基因设计RPA反应引物,收集临床确诊和疑似的52例细菌性脑膜炎患者为研究对象,采集CSF标本并提取DNA,采用RPA技术对临床CSF进行LepA基因扩增检测。结果52例患者的CSF标本经微生物培养有19例(36.5%)为阳性,阳性标本中有7例检出肺炎链球菌,这7例患者CSF标本的RPA检测结果均为阳性。微生物培养为阴性的33例(63.5%)患者中有7例患者CSF标本的RPA检测结果为阳性。共14例患者CSF标本的RPA检测结果为阳性,从中选取10例患者CSF标本的RPA扩增产物经纯化后,与肺炎链球菌LepA基因目的片段进行核酸序列比对,其比对结果一致。结论RPA技术可用于肺炎链球菌性脑膜炎病原菌的快速检测。

重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展

随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物(微生物)因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物(微生物)因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行生物成分检测而被广泛应用,尤其是新发展起来的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)、重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术。这3种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和、引物设计更简单等优点,且检测原理相似,本文对这3种技术进行对比研究,从原理、概念以及近年来在食源性致病菌快速检测方面的研究应用情况进行综述,概括其在食品检测中的优势和面临的实际问题,并对未来的发展前景进行展望。

猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。

重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流动试纸条快速检测锦鲤疱疹病毒

为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3,KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增及高灵敏度特点,简化了设备要求的同时又能做到高效检测病毒,再结合侧向流动试纸条(LFD)将RPA结果快速地可视化,提高了该疾病的检测效率。结果表明,在38℃的最适反应温度下,采用RPA-AGE技术仅需10min便可检测出病原的目标片段,结合LFD方法仅需5min便可将RPA结果通过试纸条可视化呈现。研究研发的KHV RPA-LFD检测方法简单、快捷,可为实验条件有限的养殖场快速诊断需求提供技术支撑。

重组酶聚合酶扩增技术在动物疫病诊断中的应用研究进展

重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是一种基于T4噬菌体复制机理为主要反应机理的核酸恒温扩增技术,广泛应用于动物疫病诊断、动物食品安全和遗传分析等领域。反应可在25~42℃温度条件下20 min完成快速扩增,具有条件温和、灵敏度高、特异性好、无需昂贵试验仪器和简便快捷等优点,适用于现场快速检测,已被应用于常见动物疫病的诊断。为让更多技术人员了解RPA技术诊断的优势,论文对RPA技术原理、引物探针设计、检测方法及在动物疫病诊断中的应用进行了分析。

基于重组酶聚合酶扩增技术的日本血吸虫感染性钉螺检测体系的建立与应用

确定日本血吸虫感染性钉螺是进行日本血吸虫病疫情预警的重要依据.现有日本血吸虫感染性钉螺的检测方法存在费时费力、设备昂贵、操作复杂等局限,因此研发一种易于推广和使用的日本血吸虫感染性钉螺检测方法十分必要.设计和开发一套基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的日本血吸虫感染性钉螺检测体系.该检测体系可以在恒温(39℃)条件下、快速(20 min内)检测出浓度仅为10^(3)copies/μL的目标基因;结合简单的钉螺基因组DNA提取方法,该体系可以方便、快捷地检测出1/20的日本血吸虫感染性钉螺(即20只阴性钉螺中混有1只日本血吸虫感染性钉螺).

重组酶聚合酶扩增核酸试纸条快速检测诺如病毒方法的建立与应用

旨在建立快速检测GⅠ型诺如病毒的方法与快速检测GⅡ型诺如病毒的方法。分别以GⅠ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅠ-F、Nov-GⅠ-R与探针Nov-GⅠ-probe、以GⅡ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅡ-F、Nov-GⅡ-R与探针Nov-GⅡ-probe,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过核酸检测试纸条对扩增产物进行分析鉴定。通过检测不同拷贝数的重组GⅠ型NoV阳性质粒对GⅠ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,通过检测不同拷贝数的重组GⅡ型NoV阳性质粒对GⅡ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,并与普通PCR方法和实时荧光PCR方法进行比较;以星状病毒、MS2噬菌体基因组、人轮状病毒和人腺病毒重组质粒作为模板对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法的特异性进行评价;应用建立的两种方法对市场上采集的20份食品样品进行GⅠ型NoV检测与GⅡ型NoV检测。GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法检测到最低质粒拷贝数均为101 copies/μL,且两种检测方法对其余病毒均具有良好特异性;对于从市场采集的潜在携带NoV的食品样品进行检测,结果均为阴性。本研究建立的针对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法相较于普通PCR与实时荧光PCR具有检测时间短、特异性强、灵敏度高以及检测操作简单快捷的优点,更适用于市场流通领域食品及医学检测等现场快速检测的应用。

简单异尖线虫重组酶聚合酶等温扩增检测方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的简单异尖线虫检测方法,本研究根据简单异尖线虫rDNA的ITS2基因序列设计特异引物,建立了简单异尖线虫的RPA检测方法。通过对反应体系的优化确定最优反应温度为40℃和最优反应时间为25 min。特异性检测结果显示,本研究建立的简单异尖线虫RPA检测方法与典型异尖线虫、抹香鲸异尖线虫、宫脂线虫、伪地新线虫和对盲囊线虫无交叉反应;该方法对简单异尖线虫基因组DNA最低检出限为10 pg/μL;人工污染检测结果表明,该方法能在100 g鲈鱼肉中检出单条简单异尖虫的混入污染,应用效果良好。因此,本研究所建立的简单异尖线虫RPA检测方法特异性强、灵敏度高、反应快速、无需昂贵设备,可应用于基层单位和现场快速检测。

重组酶聚合酶扩增技术在食源性致病菌检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)具有反应快速、灵敏度高、特异性强、设备依赖性低等传统国标方法及其他体外核酸扩增技术所无法比拟的优势,可广泛应用于疾病快速诊断和非实验室条件现场检测。近年来,随着RPA技术相关研究的深入,该技术已逐步渗透至食源性致病菌检测领域。本文从原理及特点出发对RPA技术在食源性致病菌检测中的应用进行综述,并对该技术的未来发展方向进行了讨论,以期为食源性致病菌的快速检测提供新思路。

利用重组酶聚合酶扩增和表面增强拉曼散射快速检测大肠杆菌耐药基因mcr-1

目的利用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)方法和表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)技术建立一种大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)耐药基因mcr-1的快速检测方法。方法首先,通过RPA特异性扩增大肠杆菌耐药基因mcr-1的保守序列。然后,以金纳米粒子(gold nanoparticles,Au NPs)作为SERS增强基底,利用便携式拉曼光谱仪采集样品的SERS光谱。最后,利用样品的特征SERS信号,实现大肠杆菌耐药基因mcr-1的快速、灵敏检测。结果样品位于505.5和840.9 cm^(-1)拉曼位移处的SERS信号强度与其浓度的对数值之间具有良好的线性相关关系,r^(2)分别为0.9827和0.9636。该方法的最低检测限为3.2×10^(-4)pg/μL,检测时间约为30min。结论本研究建立的RPA结合SERS方法检测耐药基因灵敏度高、用时短,为细菌耐药基因的快速检测提供了新思路。

重组酶聚合酶等温扩增和重组酶介导扩增技术在兽医领域的应用

近年来,随着畜牧兽医行业的发展和人民卫生水平的提高,核酸检测起着越来越重要的作用,即时检测在兽医实践中的需求十分迫切。重组酶聚合酶等温扩增(RPA)和重组酶介导扩增技术(RAA)是近年发展起来的核酸恒温扩增技术,可与侧向流层析等多种技术相结合,实现恒定温度下的快速检测。相对于PCR等传统方法,RPA和RAA具有操作简单快速、不易交叉污染、不需要大型仪器、结果判定简单明确、利于基层应用的优点,因而在兽医领域得到了广泛应用。该文对RPA和RAA技术的发展和在兽医领域的应用进行了综述。