细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中的应用分析

探究细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中的应用价值。方法 选取我院就诊的800例腹泻患者作为检验样本(2021.11~2023.11期间),使用细菌培养方法,聚合酶链反应(PCR)检测方法,探讨不同年龄段患者的细菌性痢疾检出率。结果 聚合酶链反应(PCR)检测检出率:(75.00%),(33.33%),(50.00%),(41.67%),(40.00%),(27.14%),(33.33%),(60.00%),(50.00%),(55.25%)优于细菌培养阳性检出率:(2.78%),(2.22%),(3.33%),(5.00%),(2.00%),(4.29%),(3.33%),(6.67%),(5.00%),(3.25%),(p值小于0.05)。结论 细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中,聚合酶链反应(PCR)检测方法,应用价值更为理想,可准确的评估患者是否存在细菌性痢疾疾病,有助于临床医师结合检测数据,为患者后期治疗提供理论借鉴依据,进一步改善患者的治疗效果,有临床推广及借鉴意义。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

火鸡源性成分实时聚合酶链式反应检测方法ISO标准研制

选择火鸡染色体Z DNA序列的特异片段作为检测靶序列,建立了实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,该方法种间特异性和种内一致性良好。将靶序列克隆到pUC57质粒中,通过对不同稀释浓度的质粒样品进行real-time PCR测试,该方法绝对检测限为5拷贝/PCR反应。组织国际协同实验对方法进行验证,方法的假阳性率、假阴性率均为0%,绝对检测限为5拷贝/PCR反应。根据对各实验室不同稀释浓度的质粒样品的定性测试结果对方法进行分析,结果表明,实验室间标准偏差为0.30,低于最大允许值1;在检出概率为95%的情况下,方法的绝对检测限为3.2拷贝/PCR反应,低于最大允许值20拷贝/PCR反应。将该方法提交国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO),经过标准不同的制订阶段投票、征求意见,正式上升为ISO标准(ISO/TS20224-8:2022)。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

聚合酶链反应方法检测阴道毛滴虫准确性的meta分析

目的系统评价聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的应用价值。方法检索中国知网数据库(CNKI)、万方数据知识服务平台、维普数据库和PubMed数据库自建库到2023年5月30日以来基于PCR方法检测阴道毛滴虫的研究文献。经文献筛选、数据提取后,使用软件RevMan 5.4.1和网页服务Meta-Disc 2.0进行Meta分析。结果共纳入36篇文献,16454个临床样本。Meta分析结果显示:聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的合并敏感度为0.972(0.943,0.987),合并特异度为0.979(0.968,0.986),诊断比值比为1643.398(673.168,4012.008),阳性似然比为46.209(30.549,69.897)和阴性似然比为0.028(0.013,0.059);亚组分析表明不同性别的临床样本不会影响聚合酶链反应的检测准确性,但不同的PCR检测方法的准确性有差异。结论聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的准确性较高,具有良好的应用价值。

M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术检测肺炎克雷伯菌

一直以来,人类健康都在承受着病原微生不同程度的威胁,其中肺炎克雷伯菌是常见的条件致病菌之一,当机体免疫力低下时,容易发生炎性病变,从而引起肺炎、尿路感染和败血症等院内感染。综合分析肺炎克雷伯菌的致病特征,认为快速、准确地从患者血液中检出病原菌,对感染患者进行及时的治疗具有重要意义。方法 传统病原微生物的检测有培养法、免疫检测或者生化鉴定等方法,随着分子生物学技术不断发展,使病原微生物的快速和灵敏检测成为了可能,结合我们新型的聚合酶链式反应技术,产生新的实验方法,探讨分析M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术检测的可行性以及临床样本中病原菌核酸的最优提取方法。结果 在已经建立的PCR方法中的引物作为内引物的基础上,根据RAA的引物设计原则设计RAA反应过程的外引物,筛选出最优引物对,建立RAP的方法和检测技术,预期核酸扩增特异性达到100%,检测下限达到10CFU/mL。结论 分析肺炎克雷伯菌的病原学特征、基因的特点,建立了这套灵敏度高、特异性强、反应迅速可靠的M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术,使得检测血液样本中的肺炎克雷伯菌更具特异性,有助于发现早期细菌感染患者并给予其及时的治疗,为今后肺炎克雷伯菌的准确诊断提供了新的选择。

双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系

目的建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法基于马铃薯内参UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量限、检测准确度进行评估。结果该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于0.86%~22.90%,线性决定系数r^(2)>0.99;品系特异性基因的定量限为3拷贝;不同浓度样品EH92-527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和–1.31。结论方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎的应用价值分析

目的 探究荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测脑脊液中结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的应用价值。方法 选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的存在脑膜刺激征的80例患者作为研究对象,所有患者均经MTB培养后明确诊断,将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组,疑似TBM的18例患者分入疑似组,非TBM的25例患者分入非TBM组,对3组患者行腰椎穿刺,留取5 m L脑脊液及时送检,分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率,对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。结果 脑膜炎组应用荧光定量PCR检测MTB的阳性检出率高于疑似组,差异有统计学意义(P<0.05);脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法的MTB阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。脑膜炎组患者MTB的DNA检测数值为(4.71±0.97),疑似组患者MTB的DNA检测数值为(4.35±0.83),2组患者MTB的DNA检测值比较,差异无统计学意义(t=1.351,P=0.183)。结论 应用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA,有助于判断TBM患者病情严重程度,在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值,为临床诊疗提供新思路及方向,值得临床推广应用。

基因测序技术与聚合酶链反应(PCR)技术在医学检验中的应用分析

比较基因测序技术与聚合酶链反应(PCR)在结核病诊断中的效能,为结核病的规范化诊断提供循证依据。方法 前瞻性随机对照研究。纳入2022年6月-2023年6月住院的100例疑似结核病患者,随机分为PCR组和测序组,每组50例。分别采用PCR和基因测序技术对痰液等临床标本进行检测,判断结核分枝杆菌阳性。比较两组的诊断敏感性、特异性、准确性及检测时间。结果 测序组诊断结核病的敏感性、特异性、准确性分别为96.00%、98.00%、97.00%,均高于PCR组的84.00%、90.00%、87.00%,差异均有统计学意义(P<0.05)。测序组的检测时间为(4.5±1.2)h,短于PCR组的(6.8±1.6)h(P<0.05)。结论 基因测序技术在结核病诊断中的敏感性、特异性、准确性及检测速度方面均优于PCR方法,有望成为结核病诊断的"新贵"。将基因测序技术规范化应用于结核病的常规诊断,有助于结核病的早期发现和精准治疗,对控制结核病流行,降低疾病负担,保障人民健康具有重要意义。

产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌聚合酶交联螺旋反应快速检测方法的建立

为建立一种快速检测产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌(emetic Bacillus cereus)的新型、敏感且可视化的聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)方法,本实验根据该菌结构性合成酶基因cesB设计特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,初步建立了检测emetic B.cereus的PCLSR方法。结果显示,PCLSR方法在64℃反应50 min、dNTP浓度为0.3 mol/L、Bst聚合酶浓度为8 U/管时获得最佳扩增效果。以5株emetic B.cereus和12株临床常见菌的DNA作为模板,经本研究建立的该PCLSR方法检测,结果显示,PCLSR法能有效检测5株emetic B.cereus,而对其他相关细菌的检测结果均为阴性,表明该方法特异性较强。将emetic B.cereus 10倍倍比稀释(1×10^(7)cfu/mL~1×10^(0)cfu/mL)后采用该PCLSR法、LAMP法和荧光定量PCR(qPCR)方法检测,结果显示,PCLSR法和qPCR方法的检测限均达1×10^(2)cfu/mL,LAMP法的检测限为1×10^(3)cfu/mL,表明本研究建立的PCLSR法的敏感性较高。采用“国标”中的细菌培养法、PCLSR法、qPCR法及环介导等温扩增(LAMP)法同时检测50份人工污染emetic B.cereus的饲料及灭菌牛奶样品,结果显示,PCLSR法与qPCR法检测emetic B.cereus的阳性率为30%(15/50),阴性率为70%(35/50),二者的符合率均达100%;细菌培养法和LAMP法检测emetic B.cereus的阳性率为24%(12/50),阴性率为76%(38/50),二者与PCLSR法的总符合率均为80%。综上所述,本研究建立的PCLSR法具有较强的特异性、较高的敏感性,且不需要复杂设备和昂贵试剂即可在短时间内完成对emetic B.cereus的检测,该方法的建立为基层部门对emetic B.cereus的检测及该菌的流行病学调查提供了新的技术手段。

荧光聚合酶链反应法用于新型冠状病毒核酸检测扩增产物污染治理的相关应用

目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)法用于新型冠状病毒(新冠病毒)核酸检测时扩增产物污染治理的相关应用。方法建立新冠病毒基因检测扩增产物污染模型、物面污染模型以及空间(气溶胶)污染模型,比较不同化学试剂及物理紫外线照射治理方式对物面污染和空间污染的清除效果。结果75%乙醇消毒剂组、核酸清除剂组和不同浓度有效氯制剂组的循环阈值(CT值)均明显高于对照组,其中核酸清除剂组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为34.74±2.63、34.68±3.25、35.71±3.07。500、1000、1500、2000、2500 mg/L有效氯制剂组对不同材质的CT值均高于75%乙醇消毒剂组,且有效氯的浓度越高,CT值越大,差异均有统计学意义。不同时长紫外线照射各组的CT值均明显高于对照组;其中以紫外线照射120 min组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为35.51±2.70、35.49±2.63、35.55±2.58,且紫外线照射时长越长,CT值越大,差异均有统计学意义。治理后的通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂组的CT值为36.98±3.47,明显高于治理前及其他各组,差异均有统计学意义。结论荧光PCR法用于新冠核酸检测时扩增产物污染的治理方式较多,对物面污染的治理方式可选择核酸清除剂及2500 mg/L有效氯制剂,以及紫外线照射120 min,对空间污染环境的治理方式可选择通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂联合应用,值得重视。

数字聚合酶链反应技术对甲状腺结节术前良恶性的鉴别诊断价值

目的探讨数字聚合酶链反应(dPCR)技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。方法收集2019年6月至2022年9月在该院进行超声引导下细针穿刺细胞学检查(FNAC)且接受手术治疗的甲状腺结节患者穿刺液标本141份,采用dPCR和扩增阻滞突变系统(ARMS)-PCR检测BRAF V600E基因突变,dPCR同时检测NRAS Q61R基因突变、TERT基因启动子C228T和C250T突变。以患者术后病理检测结果为金标准,比较几种方法的准确率,评价dPCR技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。结果141份穿刺液标本中,dPCR对BRAF V600E的检出率为69.50%(98/141),ARMS-PCR对BRAF V600E的检出率为64.54%(91/141),差异有统计学意义(P<0.05);dPCR检测NRAS Q61R、TERT C228T、TERT C250T在甲状腺乳头状癌(PTC)中的突变检出率分别为15.32%(17/111)、12.61%(14/111)和1.80%(2/111)。单独使用dPCR检测BRAF V600E鉴别诊断甲状腺结节良恶性的准确率为89.36%,明显高于ARMS-PCR(84.40%)和FNAC(77.30%),差异均有统计学意义(P<0.05)。dPCR(BRAF V600E)+FNAC的诊断准确率为97.16%,dPCR多基因[BRAF V600E+NRAS Q61R+TERT(C228T+C250T)]+FNAC的诊断准确率为97.87%,均高于单独dPCR(BRAF V600E)、dPCR(多基因)的诊断准确率,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论dPCR可检测出ARMS-PCR漏检的基因突变位点,也可以弥补FNAC的不足,该技术联合FNAC可提高甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断的效能。

多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌

目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella) 5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法 根据5种致病菌特异性基因片段设计并合成引物,优化多重PCR体系条件,并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果 建立的多重PCR方法可同时扩增5种目的菌株的特异性条带,且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示,该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA的检出限均为0.4 ng/μL。人工模拟样品检测结果显示,该方法可以快速且准确地检测上述5种食源性致病菌,且检出限可达到2×10^(1)CFU/g。结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重PCR检测方法。该方法的建立为罗非鱼常见食源性致病菌的快速检测提供了重要的技术手段。

抗原检测及聚合酶链反应在医院甲乙型流感病毒检测中的应用

目的分析抗原检测及聚合酶链反应(PCR)在医院甲、乙型流感病毒检测中的临床应用价值,以期为临床早期诊断、制定治疗方案提供参考。方法选取河南省洛阳市中心医院2020年1月至2023年1月诊治的120例疑似流感患者作为研究对象,入院后均采集咽拭子标本,采用抗原(胶体金法)检测甲、乙型流感病毒,实时荧光定量PCR法检测甲、乙型流感病毒核酸,比较胶体金法、实时荧光定量PCR法检测甲、乙型流感病毒的性能,分析胶体金法、实时荧光定量PCR法的稳定性及不同病毒核酸载量的胶体金法检测敏感性。结果120例疑似流感患者胶体金法检测阳性89例(甲型49例、乙型40例),实时荧光定量PCR法阳性98例(甲型55例、乙型43例);两种方法特异度、敏感度相近,胶体金法检测用时仅为15 min,实时荧光定量PCR法用时需要3 h,胶体金法检测时间明显少于实时荧光定量PCR法;2种方法检测从性别、季节、年龄方面比较对阳性结果影响差异均无统计学意义(P>0.05);胶体金法甲型流感病毒检测阳性、阴性样本核酸载量平均值比较差异有统计学意义(P<0.001);乙型阳性、阴性样本核酸载量平均值比较差异有统计学意义(P<0.001);2种试剂盒敏感性与标本病毒核酸载量呈正相关。结论胶体金法抗原检测及PCR均可用于医院甲、乙型流感病毒检测中,为临床筛查流感病毒提供参考,以制定相应干预方案。

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

聚合酶链反应配合腺苷脱氨酶和癌胚抗原检测鉴别诊断结核性和癌性胸腔积液的价值

目的分析聚合酶链反应配合腺苷脱氨酶和癌胚抗原检测对鉴别诊断结核性和癌性胸腔积液的价值。方法选取2018年1月至2022年1月普宁市人民医院收治的40例胸腔积液患者作为研究对象,根据病理检查结果分为观察组(癌性胸腔积液,共20例)和对照组(结核性胸腔积液,共20例)。两组患者均行胸腔积液样本采集,采用聚合酶链反应测量胸腔积液结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)阳性率,采用酶速率法检测腺苷脱氨酶(ADA),采用电化学发光法测量癌胚抗原(CEA)。比较两组患者检测结果的差异,并比较不同指标与三个指标联合应用的敏感度、特异度、准确度的差异。结果观察组胸腔积液TB-DNA阳性率以及ADA含量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组胸腔积液CEA含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);胸腔积液TB-DNA联合ADA及CEA检查的敏感度与准确度高于单独胸腔积液TB-DNA、ADA、CEA检查,差异有统计学意义(P<0.008);胸腔积液TB-DNA联合ADA及CEA检查的特异度高于单独胸腔积液TB-DNA、ADA检查,差异有统计学意义(P<0.008);胸腔积液TB-DNA联合ADA及CEA检查与胸腔积液CEA的特异度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论胸腔积液TB-DNA联合ADA及CEA检查在鉴别诊断结核性与癌性胸腔积液中具有较高的敏感度与准确度,可推广使用。

聚合酶链反应(PCR)检测花鲈鳗弧菌感染

从海洋鱼类重要病原菌———鳗弧菌基因库中选择金属蛋白酶基因为目标检测基因 ,以此设计一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)检测鳗弧菌的方法 ,并对此方法的灵敏性和特异性进行了研究 ,结果表明该方法对鳗弧菌的检测快速、灵敏。对人工感染鳗弧菌的花鲈组织样品进行检测 ,该方法能识别组织样品中极微量的鳗弧菌。