多重聚合酶链反应一步法用于宫颈病变患者HPV分型检测的初步研究

目的为明确多重聚合酶链反应一步法对宫颈病变患者的细胞学样本中HPV分型检测的有效性。方法研究了从西安交通大学第一附属医院妇产科收集的79例液基细胞学样本。在低度鳞状上皮内病变的患者中,高危型人乳头状瘤病毒(HPV)检测到30.3%,高度鳞状上皮内病变的40.7%,宫颈鳞状细胞癌的43.8%。结果所用样本中均未检测到HPV16感染者,这与HPV16是目前所知最常见的高危型HPV这一结论不相符。结论我们推测出现这一结果可能有两个原因:多重聚合酶链反应一步法这一检测方法在多种引物混合等方面存在漏洞;HPV的分布具有区域性差异。

一步法多重荧光定量RT-PCR检测人杯状病毒的建立及应用

目的建立检测人杯状病毒(human calicivirus,HuCVs,主要包括SV、NoV-GⅠ和NoV-GⅡ)的一步法多重荧光定量RTPCR(rRT-PCR)法。方法用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针,通过合成的对应病毒基因的质粒来评价该方法的灵敏度、特异性和重复性,检测临床标本并对阳性结果进行基因测序验证。结果建立的rRT-PCR法检测SV、NoV-GⅠ和NoV-GⅡ的灵敏度均达到103copies/mL,特异性为100%,且变异系数(CV)均≤1.275%。HuCVs检出率为21.43%(75/350),其中SV、NoV-GⅠ和NoV-GⅡ分别为14.67%(11/75)、21.33%(16/75)和64.00%(48/75)。随机选择检测阳性结果进行测序,结果均与该法检测结果一致。结论建立的rRT-PCR法可同时检测并区分SV、NoV-GⅠ和NoV-GⅡ病毒,可用于HuCVs引起的急性腹泻散发和暴发疫情的监测。

一步法实时RT-PCR检测技术在手足口病病原学检测中的应用

目的探讨一步法实时逆转录聚合酶链反应检测技术在手足口病病原学检测中的应用。方法对378例手足口病患者采集咽拭子(305份)、脑脊液(36份)、疱疹液(37份)标本,分别采用常规逆转录聚合酶链反应、一步法实时逆转录聚合酶链反应检测,比较两种方法检测EV71、CoxA16阳性率,比较一步法实时逆转录聚合酶链反应检测EV71、CoxA16及EV71+CoxA16阳性率。结果一步法实时逆转录聚合酶链反应检测EV71、CoxA16阳性率率显著高于常规逆转录聚合酶链反应(P<0.05)。EV71、CoxA16及EV71+CoxA16阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01),结论一步法实时逆转录聚合酶链反应检测能提高手足口病患者病原学检测准确性,优于常规逆转录聚合酶链反应检测。

流行性腮腺炎病毒疏水蛋白基因一步法逆转录-聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立一种简便、快速的鉴定流行性腮腺炎病毒(Mumps Virus,MuV)基因的方法,即一步法逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)。方法在MuV小疏水蛋白(Small-hydrophobin Protein,SH)基因两端设计引物,同时对所建立的一步法RT-PCR方法进行敏感性和特异性实验。结果一步法RT-PCR方法至少能检测出MuV100.7TCID50(Median Tissue Culture Infective Dose,50%组织培养感染剂量),5株MuV均呈阳性,而4株非MuV呼吸道病毒RT-PCR结果均未见阳性条带。结论一步法RT-PCR是一种快速、简便的鉴定MuV SH基因的方法。

不同核酸提取方法在HBV DNA荧光定量检测中的比较

目的研究不同核酸提取方法在HBVDNA荧光定量检测中的提取效率、重复性、抗干扰性及对扩增试剂的兼容能力。方法运用两种具有不同启动温度的Taq酶的扩增试剂分别扩增经一步法、煮沸法和磁珠法提取HBVDNA强阳性血清的模板,比较不同提取方法对扩增试剂的兼容能力。采用3种方法提取3份HBVDNA含量不同的标本各10次,进行扩增,比较不同方法的提取效率和重复性;对HBVDNA阳性标本用HBVDNA阴性的黄疸血清和溶血液进行10倍稀释后分别用前述方法提取进行干扰试验。结果 3种提取方法中,磁珠法和煮沸法提取的模板对两种扩增试剂具有良好的兼容性;重复性比较以一步法最佳,磁珠法次之,煮沸法较差;提取效率比较以磁珠法最理想,一步法次之,煮沸法最差;对黄疸和溶血的抗干扰能力以磁珠法最佳,溶血对煮沸法有一定影响,在无5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)校正的情况下,黄疸对一步法影响较大,有5-ROX校正系统分析则可以消除这种影响。结论磁珠法具有良好的重复性和提取效率,对黄疸和溶血有较强抗干扰能力,对扩增试剂的兼容性好,是一种理想的核酸提取方法;相对而言,一步法快捷且重复性更佳。

One-step RT-PCR-RFLP方法筛查新型甲型H1N1流感病毒Oseltamivir耐药株

目的分析2013年江西省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因第275位氨基酸变异情况,掌握甲型H1N1流感病毒耐药特性,为甲型H1N1流感临床治疗和疾病控制提供参考。方法收集江西省流感监测哨点医院采集的流感样病例的鼻咽拭子标本,采用狗肾传代细胞(MDCK)对标本进行病毒分离,对分离的31株新型甲型H1N1流感病毒进行核酸提取,采用一步法逆转录-聚合酶链反应(One-step RT-PCR)扩增病毒NA基因部分片段,采用限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)方法,分析扩增的部分NA基因第275位是否发生组氨酸(H)到酪氨酸(Y)的突变。结果2013年江西省31株甲型H1N1流感病毒NA基因第275位氨基酸均为组氨酸,未发生变异。结论 2013年31株毒株均对Oseltamivir敏感,One-step RT-PCR-RFLP方法筛查新型甲型H1N1流感病毒Oseltamivir耐药株简便可行。