聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的 应用PCR SSCP技术快速检测耐INH ,RFP ,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变 ,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及 2 5株结核分支杆菌敏感分离株用PCR SSCP方法分别检测 ,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中 ,rpoB、KatG、rpsLPCR扩增产物PCR SSCP分别有 2 8株 (87.5 % )rpoB基因 ,19株 (5 9.3% )KatG基因和 2 3株 (71.9% )rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H3 7Rv电泳条带相比有明显差异 ,而 2 5株结核分支杆菌敏感株的PCR SSCP条带与结核分支杆菌H3 7Rv相似 ,特异性为 10 0 %。结论 PCR SSCP方法敏感、特异 ,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变 。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变

目的 :分析瘢痕疙瘩成纤维细胞p5 3基因突变高发区第 4～ 8外显子的突变及其意义。 方法 :取手术切除的瘢痕疙瘩和非增生瘢痕各 12例 ,分别采用相应正常皮肤对照 ,体外培养成纤维细胞 ,采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术检测 p5 3基因的突变情况。 结果 :12例瘢痕疙瘩成纤维细胞标本中有 9例 p5 3基因外显子 4、5、6、7出现突变 ,非增生瘢痕标本和正常皮肤标本均未检出突变。 结论 :p5 3基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。

聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用

目的:探讨聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收的方法在基因改变检测中的应用。方法:实验于2004-09/2005-10在南方医院心内科实验室完成。样本来源:于2004-09/2005-08选择南方医院心内科收治的冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者123例,均符合WHO冠心病诊断标准,并经心电图、超声心动图、CT确诊。患者均知情同意。聚合酶链反应-单链构象多态性银染方法检测冠心病患者三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因改变,对1例怀疑存在基因改变样本的聚丙烯酰胺凝胶采用银染后单链胶回收,以胶回收后的单链聚合酶链反应产物为模板重复聚合酶链反应后进行测序。结果:在对三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因Exon7进行单链构象多态性检测时,发现一样本泳带异常,对其样本进行银染后胶回收,结合限制性内切酶酶切,证实此样本存在碱基改变,从而验证了非变性聚丙烯酰胺凝胶银染后胶回收的准确性和可行性。结论:经聚合酶链反应-单链构象多态性银染后的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶也可进行胶回收。聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中可以增强单链构象多态性基因突变检测的准确性,由于其无毒性、成本低及操作简单等优点,更易被实验人员所接受。

聚合酶链反应-单链构型多态性检测细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因变异

目的 :检测与分析淋病奈瑟菌 L 型的 cpp B基因 ,探讨细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌 cpp B基因的影响。方法 :用青霉素诱导淋病奈瑟菌成为 L 型并获得稳定 L 型纯培养物 ,用 cpp B基因特异性引物以聚合酶链反应 (PCR)检测稳定 L型纯培养物的 cpp B基因和进行单链构型多态性 (SSCP)分析。结果 :淋病奈瑟菌的细菌型及其 L型都具有 cpp B基因扩增产物 ,但 PCR-SSCP分析可见异常泳动 DNA带型 (细菌型有 2条带、L型有 3条带 )。结论 :细胞壁缺陷淋病奈瑟菌仍然具有 cpp B基因 。

聚合酶链反应-单链构象多态性分析在家族性高胆固醇血症研究中的应用

目的：探讨聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ－ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）在家族性高胆固醇血症（ｆａｍｉｌｉａｌｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ，ＦＨ）研究中的应用价值。方法：提取ＦＨ患者外周血基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及ＤＮＡ序列分析。结果：对１家２例临床诊断为ＦＨ的患儿及其父母从基因水平明确了诊断。ＬＤＬ受体基因突变是位于第６外显子的移框突变。结论：ＰＣＲ－ＳＳＣＰ可以从基因水平对ＦＨ患者明确诊断，并可对先证者家系成员早期诊断，以便提供咨询和指导。

应用聚合酶链反应-单链构象多态性技术分析结节性硬化症基因突变

目的 检测结节性硬化症基因外显子突变。方法 应用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分析 2 8例结节性硬化症患者TSC1和TSC2基因外显子突变情况。结果 2 8例中有 4例发生TSC1基因突变 ,其中包括 1个无义突变、2个错义突变和 1个移码突变 ;有 13例患者发生TSC2基因突变 ,其中包括 2个无义突变、2个移码突变、1个缺失和 8个错义突变。有 2例患者在TSC1及TSC2基因上均发生突变 ,另有 2例患者在TSC2核苷位 1960上出现同样突变。TSC1突变患者和TSC2突变患者之间临床表现无明显差异。结论 突变广泛分布于TSC1及TSC2基因各个外显子上 ,没有集聚于某个外显子 。

威灵仙的聚合酶链反应-单链构象多态性方法鉴别研究

目的利用聚合酶链反应-单链构象多态性方法(PCR-SSCP)技术建立一种快速、准确鉴别威灵仙药材基原的方法。方法查找Genbank上注册的威灵仙药材基原的内转录间隔区(ITS)序列,进行序列的比对分析,确定稳定的特异鉴别位点。据此设计能扩增包含特异鉴别位点的短片段引物,采用聚合酶链反应-单链构象多态性方法对威灵仙药材基原进行鉴定。结果不同威灵仙基原的聚合酶链反应-单链构象多态性方法谱带带型存在明显差异。结论聚合酶链反应-单链构象多态性方法方法能够快速、准确地鉴别威灵仙药材基原,为进一步开展威灵仙药材的准确鉴定奠定基础。

应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测散发性乳腺癌EMSY基因的突变

目的了解EMSY基因在散发性乳腺癌组织中的突变情况，探讨EMSY基因突变与散发性乳腺癌的关系。方法收集72例散发性乳腺癌组织及18例乳腺良性肿瘤患者的肿瘤组织，常规酚-氯法抽提组织DNA，并应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR—SSCP）的方法，扩增其EMSY基因的20个外显子，然后根据构象改变来分析此基因突变情况。结果72例散发性乳腺癌组织以及18例乳腺良性肿瘤组织中，6例样本存在第9外显子SSCP条带的异常改变，测序结果为第9外显子区GCA（丙氨酸）中的A杂合性缺失，突变率为8．3％（6／72）。结论本课题研究提示广西散发性乳腺癌中存在着EMSY基因第9外显子的缺失突变，并且在乳腺癌患者中突变率高于乳腺良性肿瘤患者。

用PCR-指纹图和PCR-单链构象多态性对骨髓移植供、受体进行HLA-D区配型

为探讨HLA血清学分型与DNA配型结果的相关性,本文建立了HLA-DQA、DQB、DPB、DRB位点聚合酶链反应-指纹图(PCR-F)、聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)配型方法,并用PCR-F、PCR-SSCP对21对骨髓供、受者进行了基因配型。与血清学结果比较,其中10对血清学配型一致的供、受体,在DQA位点PCR-F、PCR-SSCP有8对相合,在DRB位点有7对相合。提示在配型中,应用PCR-F和PCR-SSCP可发现血清学不易检测出的基因亚型。

利用PCR-SSCP技术检测中国汉族人PKD2基因的突变

目的：检测中国汉族人Ⅱ型多囊肾病基因PKD2的突变。方法：筛选临床确诊的26个中国汉族家系中31例常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）患者，提取外周血白细胞DNA，应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR－SSCP），取异常条带标本进行核苷酸序列测定，判别PKD2外显子突变位置及类型。结果：以20例健康志愿者为对照，从31例患者中成功检测出2种突变。1种为无义突变，系PKD2外显子13的第2407位碱基由胞嚼陡置换为胸腺嘧啶，形成1个终止密码子；另1种为错义突变，系PKD2外显子4的第964位碱基由胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，使编码氨基酸由精氨酸变为色氨酸。结论：本研究建立了PCR－SSCP直接检测我国汉族人PKD2突变方法，检测出2种基因突变，为今后开展ADPKD患者囊肿前诊断提供了实验基础。

红细胞丙酮酸激酶缺陷症基因变异型的研究(英文)

目的 :了解中国人红细胞丙酮酸激酶 (pyruvate kinase,PK)缺陷症的基因变异类型。方法 :应用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (polym erase chain reaction- single strand conformation polymorphism ,PCR- SSCP)和限制性内切酶酶切方法 ,分析上海地区 8个 PK缺陷症家系红细胞 PK基因变异的情况。 结果 :在 8例 PK缺陷症家系中发现 3个泳动变位片段 ,DNA直接测序证实 3例均为错义点突变 (c DNA1330 G→ T、1339C→ A、80 9G→ C)。 结论 :3个突变点分别位于 PKL R基因第 7和第 10外显子 ,导致相应的氨基酸发生置换 (4 43Ala→ Ser、44 6 L eu→ Ile、2 70 Arg→ Pro) ,造成酶活力下降 ,红细胞糖酵解途径受阻 ,临床出现慢性溶血性贫血。

p53和k-ras基因突变在大肠癌发病中的作用

目的 :探讨 p5 3和 k- ras基因突变在大肠癌中的临床意义。方法 :采用 PCR- SSCP方法检测 64例大肠癌患者癌组织及癌旁正常粘膜组织的 p5 3和 k- ras基因。结果 :64例大肠癌患者中发生 p5 3基因突变 2 8例 ( 4 3.8% ) ,发生 k- ras基因突变 2 6例 ( 4 0 .6% ) ,出现 p5 3和 kras基因协同突变 1 1例 ( 1 7.2 % )。p5 3和 k- ras基因突变与病人性别、肿块部位、大小、浸润深度及 Dukes分期无关 ;k- ras基因突变组年龄略高于非突变组 ;p5 3或 k- ras基因单一突变组易出现淋巴结转移 ,但无统计学意义 ;p5 3和 k- ras基因协同突变组淋巴结转移率 ( 1 0 /1 1、90 .9% )明显高于两者均无突变组( 7/2 1、33.3% ,P<0 .0 5 )。结论 :p5 3和 k- ras基因协同突变可能直接或间接促进了大肠癌的进一步发展。

PCR-SSCP技术应用研究进展

聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是基于PCR的单链构象多态性分子标记技术。PCR-SSCP作为检测基因突变的方法,自创立以来,经历了自身发展和完善的过程。刚建立时是将同位素掺入PCR扩增物中,通过放射自显影来显示结果,这给该技术的推广造成一定的困难。随着DNA银染方法与PCR-SSCP结合,尤其是直接溴乙锭染色方法的应用,使得该方法大大简化,操作更为简单,局限性较小,实验条件要求不高,适合一般临床实验室使用,具有简便、快速、灵敏的特点。不但被用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入,而且还可用于动物育种,微生物,寄生虫研究的多个领域。由于SSCP的突出的优点,近几年被大量地应用。

脂蛋白脂肪酶内含子3C→T突变

为筛查中国人群脂蛋白脂肪酶基因的突变情况 ,并探讨这些突变对脂蛋白代谢可能产生的影响 ,研究者利用聚合酶链反应—单链构象多态性分析技术 ,对 14 0例人群 (高甘油三酯血症组 5 1例 ,正常对照组 89例 )的脂蛋白脂肪酶基因进行了突变筛查 ,对可疑突变的扩增样品进行DNA序列测定。结果在外显子 4扩增片段 (包括内含子—外显子交界区 )有 2例可疑突变被检出 ,经测序证实均为内含子 3受位剪接位点上游 6bp的C→T转换突变杂合子。由于该突变仅见于重度高甘油三酯血症患者 ,结合国内外相关文献 ,研究者认为我国人群存在脂蛋白脂肪酶基因内含子 3受位剪接位点的C→T突变 ,该突变可能是我国人群高甘油三酯血症的遗传易患因子。

HLA-DQA1基因多态性与儿童Graves’病的相关性研究

目的 :分析重庆地区汉族儿童Graves’病 (Graves’disease,GD)与人类白细胞抗原DQA1基因 (HLA -DQA1)多态性的相关性。方法 :用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR -SSCP)及DNA测序方法 ,对已经确诊的重庆汉族GD患儿 85例和正常对照组 5 0名儿童的外周血白细胞基因组DNA的HLA -DQA1基因多态性进行分析。结果 :在GD组和对照组中检测到 7种单链构象 ,分别标为abcdefg带型。GD组中d(HLA -DQA1 0 10 2 )、f(HLA -DQA1 0 30 2 / 0 5 0 1)两带型频率 (分别为 4 3.5 % ,VS 8.0 % ;2 7.0 %VS 8.0 % )显著高于正常对照组 (χ2 =18.79,P =0 .0 0 1,RR =8.86 ;χ2 =6 .80 ,P =0 .0 0 9,RR=4 .2 7) ,而b带型 (HLA -DQA1 0 10 1/ 0 30 1)频率 (8.2 %VS 5 2 .0 % )显著低于正常对照组 (χ2 =2 9.4 3,P <0 .0 0 1,RR =0 .0 8)。结论 :HLA -DQA1 0 10 2和HLA -DQA1 0 30 2 / 0 5 0 1可能与GD易感性相关 ,而HLA -DQA1 0 10 1/ 0 30 1可能与GD的保护性相关。提示上述 3基因位点可能分别是重庆地区汉族儿童GD的易感基因和保护基因。

nm23-H1基因突变及异常表达与大肠癌转移相关性的研究

目的 :探讨nm2 3 H1基因突变及异常表达与大肠癌转移之间的关系。方法 :(1)收集 63例中国人大肠癌组织及癌旁组织 ,酚 氯仿 异戊醇法提取基因组DNA ,同时收集整理患者的临床和病理资料 ;(2 )应用PCR扩增nm2 3 H1基因全部编码序列第 2～ 5位外显子后 ,经SSCP法初步筛查基因突变并对异常带型样本进行DNA测序分析 ;(3 )应用流式细胞仪检测 14对大肠癌组织及癌旁组织nm2 3 H1蛋白的表达情况。结果 :nm2 3 H1基因第 2～ 4位外显子在 63例大肠癌组织中 (其中 2 0例标本有淋巴结转移 )未发现异常突变 ;仅有 15例大肠癌组织nm2 3 H1基因第 5外显子序列存在突变 ,其第 3 60位碱基发生T C置换 (同义突变 ) ;nm2 3 H1基因蛋白在大肠粘膜组织中有表达 ,在部分大肠癌组织中的表达比其癌旁粘膜组织低 ,并与肿瘤转移有相关性。结论 :nm2 3 H1基因突变在大肠癌组织中为小概率事件 ,大肠癌病理类型、有无转移与nm2 3 H1基因突变无明显相关性 ;nm2 3 H1基因蛋白水平的表达下降与大肠癌的转移有相关性。

结核分支杆菌利福平和链霉素耐药基因的快速检测

目的 :评估采用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分支杆菌耐链霉素 (SM )和利福平 (RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 :采用PCR SSCP技术对 86株结核分支杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rp sL基因 ,然后进行SSCP分析。结果 :以结核分支杆菌H3 7RV为对照 ,41株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为 10 0 %。 45株同时耐链霉素和利福平的耐药株中 ,3 4株 (75 6% )有rpsL基因图谱异常 ;41株 (90 1% )有rpoB基因图谱异常。结论 :rpoB基因突变和rpsL基因突变与结核分支杆菌耐利福平和链霉素密切相关 ,应用PCR SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌对链霉素和利福平耐药性。

上皮性卵巢癌中nm23-H1基因突变

目的 本文研究nm2 3 H1基因在上皮性卵巢肿瘤中的突变情况 ,以期寻找监测卵巢癌转移并能指导治疗的指标。方法 利用非同位素PCR SSCP技术研究nm2 3 H1基因的 5个外显子的突变情况。结果 正常卵巢、良性卵巢癌及交界性瘤均未发现突变 ,卵巢癌突变率显著增高。低分化程度卵巢癌突变率高于高、中分化程度的卵巢癌。浆液性卵巢癌nm2 3 H1基因突变率高于其他组织学类型。Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌突变率高于Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌。发生淋巴结转移的卵巢癌突变率高于无淋巴结转移的卵巢癌。结果 nm2 3 H1基因突变容易发生于分化程度较低、有淋巴结转移的晚期卵巢癌病例中。