聚合酶链式反应联合反向斑点杂交法对于β-地中海贫血的筛查价值

目的:对β-地中海贫血(βthalassemia,β-TM)患者的进行基因分析,了解β-TM患者的基因突变类型。方法通过全血细胞分析,筛查出MCV﹤80fL,MCH﹤27pg,Hb﹤110g/L的贫血患者,然后进行血红蛋白电泳分析,通过诊断标准:MCV﹤80fL,HbA2>3.2%,HbF>3.1%为阳性患者219例,进一步应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)结合反向斑点杂交技术(reverrsedotblot, RDB),检测其基因突变类型。结果进行基因检测的219例患者中,男性127例,女性92例,进行PCR-RDB法的基因诊断共检出5种突变基因: CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C-T)、TATAbos-28(A-G)、CD17(A-T)、CD14-15(+G)。其中以CD41-42(-TTCT)突变类型占首位,IVS-Ⅱ-654(C-T)突变类型次之。结论PCR-RDB法的基因诊断相对敏感度,特异性高以及诊断的阳性率高。

聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB_1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。

聚合酶链反应和反向斑点杂交技术检测人乳头瘤病毒感染

目的:研究聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和反向斑点杂交(reverse dot blot,RDB)技术在人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染检测中的情况,进一步研究其应用价值。方法:收集2013年3月至2015年6月宫颈癌、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变三种类型疾病共320例脱落细胞标本,采用PCR和RDB杂交技术对HPV基因型进行检测,分析检测数据。结果:在宫颈癌、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变的感染中HPV单基因型感染均多于多重基因型感染,但不同疾病中单基因型感染患者比率差别不明显,分别为82.50%、84.06%、84.30%;不同疾病中多重基因型感染患者例数分别为17.50%、15.94%、15.70%,两种类型感染情况比较,差异无统计学意义(P>0.05);320例标本中检测出的210例阳性标本进行分型,反复检验后数据显示HPV16为最主要的感染基因型。结论:PCR和RDB技术是HPV基因型检测的有效方法,也是关于进行HPV感染防治的有效检测指标。

聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核杆菌的临床应用及其评价

目的 对聚合酶链反应 ( PCR) -微孔板杂交法检测结核杆菌的临床适用性和可行性进行评价。方法 收集 1130份临床标本 ,分别用抗酸染色、培养、PCR电泳及 PCR微孔板杂交法进行结核杆菌检测 ,并结合临床诊断和疗效观察对实验结果进行分析。结果 10 0份临床证实无结核病的体液标本经抗酸染色和 PCR电泳 ,分别有 1例和 2例假阳性 ,但经培养和 PCR微孔板杂交法未查出阳性 ;其余 10 30份高度怀疑含有结核杆菌的体液标本的检测结果 ,以 PCR微孔板杂交阳性检出例数最高 ( 481/ 10 30 ) ,其次为 PCR电泳 ( 40 6 / 10 30 )、培养 ( 36 5 /10 30 )以及抗酸染色 ( 2 5 6 / 10 30 ) ;χ2 检验结果显示 ,PCR微孔板杂交的结核杆菌阳性检出例数与其它三种方法比较均呈显著或极显著性差异 ( P<0 .0 0 83及 P<0 .0 0 17)。结论 PCR-微孔板杂交方法是特异、灵敏、准确、快速的结核杆菌检测方法 。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测人IL-6mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录—聚合酶链反应—微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL-6mRNA的方法。方法:从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,用链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物系统检测杂交信号。结果:该方法检测IL-6mRNA的灵敏度明显高于逆转录—聚合酶链反应—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于细胞因子mRNA的定量检测。

聚合酶链反应-直接测序法在强直性脊柱炎患者HLA-B27检测中的应用

目的探讨聚合酶链反应-直接测序法(polymerase chain reaction sequence-based typing,PCR-SBT)检测人类白细胞抗原B27(human leukocyte antigen B27,HLA-B27)在强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)临床诊断中的价值。方法应用PCR-SBT法和临床常用的IMS-ELISA法对120例疑似AS患者外周血进行HLA-B27检测。以SPSS17.0软件的配对χ2检验和受试者工作特征曲线下面积对两种方法检测HLA-B27在AS诊断中的价值进行评价。结果 120例疑似AS患者中,PCR-SBT和IMS-ELISA法HLA-B27检测阳性率分别为45.83%(55/120),37.50%(45/120)。两种方法检测HLA-B27有统计学差异(P=0.031)。PCR-SBT法敏感度和特异度分别为96.36%,96.92%;IMS-ELISA法的敏感度和特异度分别为69.09%,89.23%。两者的AUC分别为0.966和0.792。结论与传统的IMS-ELISA法相比,在AS的临床诊断中PCR-SBT法检测HLA-B27的敏感度和特异度更高,方法更优。

聚合酶链反应-酶联免疫法筛选孢子丝菌特异性探针

目的筛选出对孢子丝菌结合效率相对较高的探针。方法以50株纯培养的孢子丝菌及标准株为样本,以毛霉、烟曲霉、念珠菌各1株为阴性对照,用聚合酶链反应-酶联免疫法(PCR-ELISA)对已报道的5个孢子丝菌特异性探针(U26852、U26866、U26866'、M85053及AF117945)进行筛选。记录各探针与合成DNA片段杂交底物显色与否及酶免疫测定指数(EI)值。结果 PCR产物测序证实5个探针均位于产物序列上;在相同的ELISA条件下,探针U26852显色最强,EI值最高。结论针对28Sr RNA的探针U26852是目前与孢子丝菌结合效率相对较高的探针。

聚合酶链反应-酶免法检测肺癌组织端粒酶活性

目的 :探讨肺癌组织中的端粒酶活性。方法 :用聚合酶链反应—酶免法检测 70例肺癌患者的纤维支气管镜活检组织端粒酶活性。结果 :70例原发性肺癌组织中 ,有 5 7例端粒酶活性表达阳性 ,其阳性率为 81 4% ,小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌 (NSCLC)分别为 92 9% ( 13 /14 )和 78 6% ( 4 4/5 6)。结论 :肺癌组织中普遍存在端粒酶活性 ,端粒酶活性检测可作为肺癌诊断标志物之一。

诺如病毒RT-PCR-反向斑点杂交检测方法的建立

旨在建立诺如病毒RT-PCR-反向斑点杂交检测方法。选取诺如病毒较为保守的RdRp基因作为扩增对象,经RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中。以重组质粒为模版,选择合成寡核苷酸探针及生物素标记引物。生物素标记引物的扩增产物经热变性后与固定在硝酸纤维素膜上的探针进行杂交反应,经显色后判定结果。出现明显的蓝紫色斑点为诺如病毒阳性,如无斑点则为阴性。对5份临床样品进行检测,并以RT-PCR对比验证。结果显示,利用反向斑点杂交法对重组质粒的检测限为100拷贝/μL,在5例实际样品检测中有1例为阳性,与RT-PCR判定结果一致。建立了诺如病毒的RT-PCR-反向斑点杂交检测方法,该方法特异性好,灵敏度高,操作简便,具有重要的应用价值。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

反向斑点杂交快速检测肺炎链球菌

目的:建立一种利用DNA探针快速检测肺炎链球菌的反向斑点杂交方法。方法:在肺炎链球菌特异的自溶素基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成1段263bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的检测。结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他细菌间无交叉反应,该方法能检测出10ng细菌DNA。50份痰标本肺炎链球菌培养阳性者8份,杂交阳性者12份,PCR阳性者18份。结论:反向斑点杂交具有快速、敏感、特异的优点,对肺炎链球菌的快速诊断有重要意义。

反向斑点杂交法快速检测肺炎支原体

目的:探讨早期、快速检测肺炎支原体的方法。方法:根据肺炎支原体特异的P1基因设计引物,通过聚合酶链反应合成一段特异的162bp长链DNA探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记支原体DNA,并应用于痰标本的检测。结果:所合成的162bpDNA探针具有高度特异性,只和肺炎支原体杂交,与其它细菌、真菌、病毒无交叉反应,该探针最低可检测出1ng的DNA。杂交法和培养法分别检测100份痰标本,两者的阳性率分别为12%和2%。结论:该方法快速、特异,对肺炎支原体的早期诊断具有较高的应用价值。

应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种

目的:应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌至种的水平。方法:以分枝杆菌rpoβ基因编码序列为靶基因,应用PCR-RDBHA检测126株分枝杆菌临床分离株。以PCR-DNA测序为对照,对经PCR-RDBHA鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)的临床分离株进行PCR-DNA测序。结果:126株临床分离株中,经鉴定115株(91.3%)为结核分枝杆菌复合群(MTC),11株(8.7%)为NTM。NTM中,4株胞内分枝杆菌,1株堪萨斯分枝杆菌,1株戈登分枝杆菌,2株瘰疬分枝杆菌,3株脓肿分枝杆菌。11株NTMPCR-RDBHA与PCR-DNA测序结果一致。结论:PCR-RDBHA能鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,方法简便、快速,结果准确,具有良好的临床应用价值。