导流杂交基因芯片法和聚合酶链反应-反向点杂交法检测人乳头瘤状病毒亚型的比较

目的探讨导流杂交基因芯片法和聚合酶链反应-反向点杂交法检测人乳头瘤状病毒(HPV)亚型的差异。方法随机选取HPV标本50例,分别用导流杂交基因芯片法和聚合酶链反应-反向点杂交法检测HPV亚型,比较检测结果,结果不相符或部分相符的标本采用基因测序方法验证。结果两种方法检测结果,19例阴性标本和25例阳性标本完全相符,共44例检测标本结果完全相符,绝对符合率88%(44/50);4例检测结果部分相符,相对符合率96%(48/50),4%不相符(2/50)。结论导流杂交基因芯片法和聚合酶链式反应-反向点杂交法检测HPV-DNA型别检出结果类似,均能快速、准确地检测HPV感染。

聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB_1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。

多重聚合酶链反应和反向线性点杂交技术在常见呼吸道病毒检测中的应用

目的应用多重聚合酶链反应(mPCR)扩增基因技术和反向线性点杂交技术(RLB)相结合的方法从基因水平建立常见呼吸道病毒的检测方法。方法根据常见的7种呼吸道病毒包括流感病毒A,副流感病毒1、2、3型,腺病毒1型,呼吸道合胞病毒A、B型的特点设计特异性的引物和探针,应用mPCR/RLB技术对常见的7种病毒株进行检测,建立研究方法。结果使用特异性引物对7种病毒株的基因进行mPCR,均得到相应的目标扩增产物,扩增条带清晰,与目标片段一致。7种病毒株的PCR产物与特异性探针杂交,均可得到清晰的杂交模式,并且彼此之间没有交叉反应,与作为阳性对照的细菌标准菌株亦没有交叉反应。结论 mPCR和RLB相结合是从基因水平检测常见呼吸道病毒的方法 。

聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核杆菌的临床应用及其评价

目的 对聚合酶链反应 ( PCR) -微孔板杂交法检测结核杆菌的临床适用性和可行性进行评价。方法 收集 1130份临床标本 ,分别用抗酸染色、培养、PCR电泳及 PCR微孔板杂交法进行结核杆菌检测 ,并结合临床诊断和疗效观察对实验结果进行分析。结果 10 0份临床证实无结核病的体液标本经抗酸染色和 PCR电泳 ,分别有 1例和 2例假阳性 ,但经培养和 PCR微孔板杂交法未查出阳性 ;其余 10 30份高度怀疑含有结核杆菌的体液标本的检测结果 ,以 PCR微孔板杂交阳性检出例数最高 ( 481/ 10 30 ) ,其次为 PCR电泳 ( 40 6 / 10 30 )、培养 ( 36 5 /10 30 )以及抗酸染色 ( 2 5 6 / 10 30 ) ;χ2 检验结果显示 ,PCR微孔板杂交的结核杆菌阳性检出例数与其它三种方法比较均呈显著或极显著性差异 ( P<0 .0 0 83及 P<0 .0 0 17)。结论 PCR-微孔板杂交方法是特异、灵敏、准确、快速的结核杆菌检测方法 。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测人IL-6mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录—聚合酶链反应—微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL-6mRNA的方法。方法:从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,用链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物系统检测杂交信号。结果:该方法检测IL-6mRNA的灵敏度明显高于逆转录—聚合酶链反应—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于细胞因子mRNA的定量检测。

PCR-反向点杂交法在结核杆菌耐药突变基因检测中的应用

目的了解深圳结核病患者结核杆菌耐药基因突变和耐药情况,评价PCR-反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的方法学性能。方法采用PCR-反向点杂交法检测264例(初治患者141例,复治患者123例)临床分离结核杆菌菌株或经抗酸染色镜检为阳性的痰标本中结核杆菌13个耐药基因突变位点。以DNA测序法为金标准,评价PCR-反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的方法学性能。结果 264例结核病患者对4种常用抗结核药物中1种或以上耐药者90例,耐药率34.09%,其中耐多药率19.32%。141例初治患者耐药率为17.73%,耐多药率为4.96%。123例复治患者耐药率为52.85%,耐多药率35.77%。对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的耐药率分别为22.73%、20.45%、15.91%和6.82%,相应最常见突变位点分别为315M、S531L、43M和306M2。突变位点检出率超过5%的为315M(28.74%)、43M(20.69%)、S531L(15.52%)、15M(8.62%)、306M2(6.90%)和H526Y(5.17%)。PCR-反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的敏感度为94.74%、特异度为100%、准确度为98.11%,Kappa值为0.958 4(95%CI:0.837 9～1.078 9)。结论深圳结核病患者对抗结核药物耐药率和耐多药率均较高,复治患者耐药率和耐多药率分别比初治患者高2倍和6倍,对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的耐药性依次降低,相应最常见耐药基因突变位点分别为315M、S531L、43M和306M2。PCR-反向点杂交法检测结核杆菌耐药基因突变的敏感度、特异度和准确度均能满足临床要求,适合临床实验室使用。

反向斑点杂交法快速检测肺炎支原体

目的:探讨早期、快速检测肺炎支原体的方法。方法:根据肺炎支原体特异的P1基因设计引物,通过聚合酶链反应合成一段特异的162bp长链DNA探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记支原体DNA,并应用于痰标本的检测。结果:所合成的162bpDNA探针具有高度特异性,只和肺炎支原体杂交,与其它细菌、真菌、病毒无交叉反应,该探针最低可检测出1ng的DNA。杂交法和培养法分别检测100份痰标本,两者的阳性率分别为12%和2%。结论:该方法快速、特异,对肺炎支原体的早期诊断具有较高的应用价值。

反向点杂交法快速检测HPV基因型的临床应用

应用反向点杂交法（ＲＤＢ）的原理，针对ＨＰＶ６Ｂ，１１，１６，１８，３１，３３和３５设计了７条序列作为未标记的特异性寡核苷酸（ＳＳＯ）探针，分别固定在尼龙膜条上，形成７个点，再与经ＰＣＲ扩增的样品ＤＮＡ序列杂交，即可在一个膜条上分辨出这７型ＨＰＶ中的任一型．此法快速简便，特异性高，不存在假阳性；且因ＰＣＲ灵敏度高，亦不易出现假阴性．用ＰＣＲＲＤＢ法检测保存的宫颈癌组织石蜡包埋标本３２例，结果：ＨＰＶ１６阳性２２例（６８８％），ＨＰＶ１８阳性５例（１５６％），ＨＰＶ１６／１８双重感染２例（６３％），阴性仅３例（９３％）．

反向线点杂交方法检测和鉴定4种常见致病支原体

目的评价反向线点杂交方法检测生殖支原体、人型支原体、微小脲原体和解脲脲原体的敏感性。方法应用支原体反向线点杂交方法和种特异性PCR方法同时检测198例临床标本,比较两种方法的检测结果。结果支原体反向线点杂交方法和种特异性PCR检测支原体阳性率分别为33.3%和34.3%,两种方法检测结果符合率为98.5%。3例标本支原体种特异性PCR方法检测微小脲原体阳性,而反向线点杂交方法检测为阴性。两种方法检测支原体结果无显著性差异(P>0.05)。结论反向线点杂交方法能同时快速、敏感和特异的检测这4种支原体。

反向斑点杂交法检测流感嗜血杆菌核酸

目的 探讨早期、快速检测流感嗜血杆菌的方法。方法 应用流感嗜血杆菌编码外膜蛋白特异的P6基因设计引物 ,通过聚合酶链反应合成特异探针 ,采用反向斑点杂交法检测生物素标记DNA ,并应用于痰标本的检测。结果 只有流感嗜血杆菌扩增出 35 1bp的DNA片段 ,该探针能检测出 10ng的细菌DNA ,与其他细菌、病毒、真菌无交叉反应。该方法和培养法分别检测 5 0份痰标本 ,两者的阳性率分别为 30 %和 2 2 %。结论 该方法快速、特异 。

聚合酶链反应检测实验动物弓形虫核酸的研究

建立弓形虫动物模型，常规方法提取肝、脾、肾、肺等组织DNA，应用聚合酶链反应（PCR）扩增，产物经电泳检测显示199bp的弓形虫特异带谱。并以γ－32p标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针，对扩增产物行Southern印迹分析，结果上述4种标本均出现阳性杂交带，进一步证实扩增条带是弓形虫特异DNA顺序。同时用酶标法检测显示鼠血清弓形虫抗体IgG；阳性。组织病理学检查结果，肝组织损伤较严重，肝细胞肿大，肝窦消失，脾、肾、肺组织可见轻微的病理改变。另外本文介绍一种简单PCR方法[1]，取鼠尾静脉血2μl直接进行扩增，结果与酚-氯仿法提取的DNA扩增结果一致。

人乳头瘤病毒反向点杂交检测方法的研究

目的 通过检测正常孕妇及胎儿HPV的感染情况 ,探索建立一种简便、有效的HPV检测方法。方法 在以GP5+ / 6+ 为引物的人乳头瘤病毒检测方法的基础上 ,利用生物素标记引物 (bio -GPbt) ,进行GP -PCR ,并用此PCR产物与特异性内寡核苷酸探针 (SIOP)进行反向点杂交 (RDBH) ,从而达到检测HPV感染并对其分型的目的。结果 1 .在对 1 1 9份样品的检测中 ,普通 2 %琼脂糖电泳的阳性率为 30 3 %(36/ 1 1 9) ,而反向点杂交的阳性率为 43 7%(52 / 1 1 9) ,两者之间差别有显著性 (χ2 =4 0 568,0 0 1 <P <0 0 5) ,说明反向点杂交 (RDBH)在HPV的检测中有较高的敏感性 ;2 .在用于检测的 4个HPV探针 (6B、1 1、1 6、1 8)之间 ,未发现非特异性的杂交 ,说明反向点杂交 (RDBH)

霍夫变换在PCR-反向点杂交检测结果自动化判读中的应用

探讨霍夫变换(Hough transform)在聚合酶链反应-反向点杂交(polymerase chain reaction-reverse dot blotting,PCR-RDB)检测基因突变结果的自动化判读中的应用。以凯普HMM-2I医用核酸分子快速杂交仪检测基因突变为例,建立一种通过霍夫变换进行图像识别的方法,以快速判读PCR-RDB的检测结果,并提出一套基于移动终端的检测结果后处理方案。利用开发的软件,对113份地中海贫血常见突变以及86份人乳头瘤病毒分型的PCR-RDB检测结果进行了自动读取,并同人工判读结果进行了比较,二者的符合率均达100%。将霍夫变换应用于PCR-RDB检测图像的自动化判读符合实际需求,无需人工干预,可以降低肉眼判读的错误率并提高工作效率。

聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法 以 16SrDNA为靶序列 ,采用聚合酶链反应 (PCR) 反向斑点杂交检测 2 5种分枝杆菌、11种非分枝杆菌标准株、10株分枝杆菌临床分离株和 2 6份临床痰标本。结果 分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经DNA扩增 ,分枝杆菌均出现 5 78bpDNA片段 ,非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外 ,其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出 10 0fg结核分枝杆菌DNA。探针特异性试验表明 ,17种寡核苷酸探针除pTub1、pFor1、pSme探针可见交叉杂交外 ,其余探针均是特异的。 10株结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌临床分离株PCR 反向斑点杂交结果与常规鉴定结果相符。 2 6份涂片阳性痰标本经该法直接鉴定为结核菌复合体。结论 16SrDNAPCR 反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种快速、有效 ,具有较高的应用价值。