聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB_1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

自行构建人类白细胞抗原DQA1位点基因分型寡核苷酸芯片性能评价:100例样本与PCR-SSP法的比较

背景:人类白细胞抗原等位基因分型对器官移植和法医鉴定等有重要意义。目前的分型方法难以实现高通量和集成化,准确性和重复性也不理想。目的:比较自行构建的寡核苷酸芯片与序列特异性引物-聚合酶链反应(polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP)两种方法用于人类白细胞抗原DQA1基因分型的结果,以评价寡核苷酸芯片的性能。方法:纳入2006-01/2009-03于中国医科大学附属第一医院血液科门诊就诊的患者100例。分别用等位基因特异的PCR-SSP和自行构建的寡核苷酸芯片对患者的人类白细胞抗原DQA1进行分型。寡核苷酸芯片分型采用荧光标记的组间特异性引物扩增基因组DNA,扩增后的产物与分型芯片的探针杂交,由杂交产生的荧光信号确定人类白细胞抗原DQA1位点基因型。比较两种方法分型所获得的结果,不吻合的样本经第三方测序验证。结果与结论:100例临床样本经寡核苷酸芯片和PCR-SSP分型全部成功。分型结果的吻合率为94%。不吻合样本6例,其中4例PCR-SSP定型为杂合子,芯片分型全部为纯合子。经第三方验证,证实芯片的分型全部正确。另外2例不吻合的样本经测序,证实SSP分型错误1例,芯片分型错误1例。芯片的重复率为95%。说明自行构建的寡核苷酸芯片的特异性和灵敏度都能满足基因分型的需要,且稳定性较好。

沈阳汉族群体HLA Ⅰ类基因座PCR-序列特异性寡核苷酸探针分型研究

目的检测和分析沈阳汉族HLA-A、-B、-Cw位点等位基因的多态性。方法采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针杂交分型方法对108名沈阳籍健康献血员进行HLA-A、-B、-Cw等位基因分型。结果检出等位基因HLA-A位点21个,B位点43个,Cw位点23个;所有位点的等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论从基因水平分析了HLAⅠ类基因的群体分布特征,提供了沈阳汉族群体HLAⅠ类基因座更准确的基因频率。

流式磁珠反向SSOP杂交法误判HLA基因型的原因分析(附4例报告)

目前对人类白细胞抗原的基因分型技术有多种,包括序列特异性引物-聚合酶链反应（polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP）,多聚酶链反应序列特异性寡核苷酸探针（PCR-sequence specific oligonucleotide probe,PCR-SSOP）杂交法,基因芯片法和DNA直接测序法（sequence-based typing,SBT）。基于Luminex的流式磁珠反向SSOP杂交法具有快速、高准确率、高通量、重复性好等优点,

流式磁珠PCR-SSOP方法HLA基因分型可疑结果的确认分析

目的对PCR-SSOP方法未明确HLA分型结果的可疑样本进一步分型,并分析原因。方法对采用PCRSSOP方法进行HLA分型出现的131例可疑样本采用LABScan3D分型方法进行检测。对于3D分型仍不能确定的样本采用PCR-SBT分型方法进行检测。结果 131例可疑样本分析,其中87例LABScan3D分型方法可确定分型结果,余下的44例采用PCR-SBT获得分型结果,3种分型方法检测结果在低分水平上是完全一致的。结论 LABScan3D分型方法在PCR-SSOP的基础上进一步发展,可代替其进行大量样本的HLA分型,但是仍有引物探针的局限,不能代替SBT的地位。

一例白血病患者及家系HLA-B基因全长序列及18个点突变分析

背景:人类白细胞抗原HLA经过长期进化形成丰富的多态性,近几年由于受检人数增加及HLA分型技术快速发展,HLA新基因不断被发现。目的:采用下一代测序技术对1例白血病患者及家系HLA-B基因的全长序列及18个点突变进行分析。方法:应用序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP)及聚合酶链反应-直接测序法(PCR-SBT)发现患者的HLA-B结果异常。为了鉴定该基因,采用下一代测序技术对该基因全长进行测序,同时采集患者父亲、母亲及2位同胞姐妹的血样进行HLA基因的遗传学分析。结果与结论:应用序列特异性寡核苷酸探针杂交及聚合酶链反应-直接测序法均提示该样本HLA-B无完全匹配的基因型。应用下一代测序技术分析发现,与同源性最高的等位基因B*15:09:01相比,该基因在外显子、内含子和3′UTR共存在18个碱基突变。5个外显子碱基突变位于第3,4外显子,分别为:第486位G→C、第583位T→C、第636位T→C、第652位A→G和第756位C→T,导致5个相应密码子发生改变,其中2个碱基替换为错义突变,第171位酪氨酸(Tyr)→组氨酸(His)、第194位异亮氨酸(Ile)→缬氨酸(Val)。家系调查显示患者HLA-B新基因来源于父亲。新基因序列已递交给Genbank数据库(MG595995)。应用下一代测序技术鉴定了1个HLA-B新等位基因,该基因于2017年12月被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*15:435。

HLA-Ⅱ血清学分型与微量SSP法基因分型的比较分析

目的验证微量序列特异性引物(SSP)技术进行HLA-Ⅱ类移植配型的准确性并探讨血清学分型错误发生的原因。方法采用聚合酶链反应结合微量SSP技术(简称微量PCR-SSP法)以及单克隆抗体血清学分型技术对血清样品进行HLA分型并比较其结果。结果(1)微量PCR-SSP法检测的110例样本中,99例检出HLA-DR的396个等位基因、11例检出HLA-DQ的22个等位基因,检出10%的单倍型个体;(2)两种方法对比研究发现单克隆抗体血清学分型检出错误或漏检率较高,其误差在DR和DQ分别为38.81%和50.75%;(3)错误发生和易混淆的抗原为:DR15/16、11/12、13/14、8、12和DQ5/6、8/9。结论微量SSP法可以准确检定血清学易漏检和发生错误的抗原等位基因。

河北汉族HLA-A基因多态性及其分布特征

目的了解河北省汉族人群人类白细胞抗原HLA-A等位基因多态性及分布特征。方法采用序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应(PCR-Sequence Specific Oligonucleotide Probing,PCR-SSOP)方法,对5908名河北汉族捐献造血干细胞健康志愿者的HLA-A等位基因作低分辨基因分型检测,采用方根法计算HLA-A基因频率,并进行群体比较。结果河北汉族人群中共检出18个HLA-A基因,呈现较高的基因多态性,包括过去很少被检测到的HLA-A25,A74,其中A座位最常见基因依次为:A*02、A*11、A*24、A*01、A*30、A*03、A*33。结论河北汉族人群HLA-A基因分布有自己的特点,各等位基因频率介于南北汉族之间,但更接近于中国北方汉族人群,符合地域分布特征。

PCR-SSP法HLA-A、B基因分型与血清学分型的比较

目的比较聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)进行HLA-Ⅰ类A、B抗原位点分型的准确性,并探讨血清学分型错误发生的原因。方法用PCR-SSP以及单克隆抗体血清学分型技术对HLA-A、B分型并比较。结果34例样本PCR-SSP基因分型无假阳性和假阴性出现。PCR-SSP法与血清学比较,血清学检出错误或漏检率分别为HLA-A位点23.5%,B位点26.5%。血清学发生错误或易混淆的抗原有:A2和A68、A32和A33,B5、B60和61。结论PCR-SSP法进行HLA-A、B抗原等位基因分型具有分辨率高、特异性强、重复性好、实验过程简捷快速、分型结果较血清学更加准确可靠的优点。

Flow-rSSO与PCR-SSP方法在骨髓库HLA基因分型中的应用比较

目的比较流式反向序列特异性寡核苷酸探针方法(Flow-rSSO)与聚合酶链式反应-序列特异性引物方法(PCR-SSP)在骨髓库人类白细胞抗原(HLA)分型中的应用价值。方法4769例中华骨髓库质控样本中,已采用PCR-SSP方法分型的3509例标本应用FLOW-rSSO方法复检,而1260例已采用FLOW-rSSO方法分型样本则应用PCR-SSP方法复检,结果不一致样本采用PCR-测序分型方法(SBT)进行确认。结果PCR-SSP方法HLA分型错误率(6.84‰)明显高于Flow-rSSO方法(1.59‰),其中PCR-SSP方法中75%的错误结果是由于漏检造成;PCR-SSP方法的模棱两可分型结果比例(2.56‰)明显低于Flow-rSSO方法(16.67‰)。结论PCR-SSP方法和FLOW-rSSO方法均适合应用于中华骨髓库供者的HLA分型,但HLA分型实验室有必要同时建立两种HLA分型方法。

PCR-SSP/PCR-SSO两种KIR基因分型方法的比较

目的杀伤细胞免疫蛋白样受体(KIR)基因在自然杀伤细胞活性调节、机体抗感染、移植免疫过程中发挥重要作用。在脐带血移植中,KIR基因分型的效率和准确关系到移植的成败。为了满足临床上对KIR基因分型的要求,对比分析聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)和聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)两种方法,试图建立一个高效便捷检测KIR基因分型的方法学体系。方法从2018年到2019年已外送到第三方检测实验室(北京博富瑞医学检验实验室有限公司)做过KIR基因分型检测的脐带血样本中随机取出12份,分别用PCR-SSP及PCR-SSO商品化试剂盒进行KIR基因分型检测,并通过凝胶电泳分析或MATCH IT!DNA软件分析,获取KIR基因分型结果。结果12例脐带血样本中,PCR-SSO方法学检测的结果与原PCR-SSO方法检测结果完全一致,PCR-SSP方法学检测的结果与原PCR-SSO方法检测结果9例相同,有2例因出现漏孔而无法判读,有1例出现了假阳性带。结论PCR-SSO方法学检测KIR基因效果优于PCR-SSP,但是PCR-SSO方法学也存在当微珠的荧光校准值接近于临界值时,结果出现错判的现象;为保证KIR基因分型的准确度,建议PCR-SSP方法出现漏孔或者PCR-SSO方法荧光校准值接近于临界值时两种方法相互验证。

ABO疑难血型鉴定中应用PCR-SSP法的探讨

目的对ABO疑难血型鉴定中应用PCR-SSP法的临床价值进行探讨。方法选取2015年1月~2016年12月我院收治的225例ABO疑难血型受试者,分别给予PCR-SSP法和血清学定型方法进行检测,对比相关数据差异。结果 PCR-SSP法与血清学定型方法的检测结果比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中临床应用价值高,值得临床输血工作者关注。

重症肌无力患者HLA-B易感基因研究

目的探讨中国汉族重症肌无力(MG)患者及其不同亚型与人类白细胞抗原(HLA)-B等位基因的相关性。方法应用聚合酶链反应-序列特异性的寡核苷酸探针杂交法(PCR-SSOP)对91例中国汉族MG患者及171名健康对照者进行HLA-B等位基因分型,并采用病例-对照研究及显性遗传模式的方法系统分析HLA-B等位基因与MG患者不同临床亚型之间的相关性。结果按照性别、年龄、临床类型、抗乙酰胆碱受体(AChR)抗体及胸腺病变将患者组分为不同亚型后,结果显示HLA-B*46阳性率在男性、眼肌型、抗AChR抗体阴性及伴发胸腺瘤组中升高,HLA-B*08阳性率在早发型及全身型患者组中升高。与对照组比较,患者组HLA-B*35和B*38阳性率降低。结论 HLA-B*46基因可能是男性、眼肌型、抗AChR抗体阴性及伴发胸腺瘤的MG患者的易感基因或与易感基因相连锁;HLA-B*08可能是早发型及全身型MG患者的易感基因或与易感基因相连锁。HLA-B*35和B*38可能是MG的保护基因或与保护基因相连锁。

36380名河北汉族HLA供者基因多态性及其分布特征

目的了解河北省汉族人群人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1基因多态性及分布特征。方法采用序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应(PCR-Sequence Specific Oligonueleotide Probing,PCR-SSOP)方法,对36 380名河北汉族捐献造血干细胞健康志愿者的HLA-A、B、DRB1基因作低分辨基因分型检测,采用方根法计算HLA-AB、DRB1基因频率,并进行群体比较。结果河北汉族人群中共检出18个HLA-A基因43个HLA-B基因和14个HLA-DRB1基因,呈现较高的基因多态性,包括过去很少被检测到的HLA-A*25,A*74,B*42,B*53,B*73,DR*18。,其中A座位最常见基因依次为:A*02、A*11、A*24、A*30、A*01、A*03、A*33 B座位最常见基因依次为:B*13、B*1501(B62)、B*51、B*4002(B61)、B*4001(B60)、B35,B46DRB1座位最常见基因依次为DRB1*15、DRB1*07、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*04、DRB1*11和DRB1*14,结论河北汉族人群HLA-A、B、DRB1基因分布有自己的特点,各基因频率介于南北汉族之间,但更接近于中国北方汉族人群,符合地域分布特征。

PCR-RSSO基础上HLA-Ⅰ、Ⅱ基因分型的研究

目的：通过对PCR－DNA技术的分析，探讨人类白细胞抗原（HLA）基因分型方法。方法：采用PCR反向序列特异性寡核苷酸（polymerase chain reaction-reverse sequence specific oligonucleotide,PCR-RSSO)杂交技术，建立改良半量扩增体系全自动HLA－I、Ⅱ等位基因分型方法，进行了635份血液标本HLA－A、B、C、DR、DQ等位基因分型，其中166份DNA同时采用序列特异性引物技术（PCR－SSP）和手工全量扩增体系PCR－RSSO技术。对全自动半量PCR－RSSO、PCR－SSP、手工PCR－RSSO 3种方法做两两比较。结果；全自动半量PCR－RSSO的分型成功率为98．4％（3124／3175），PCR－SSP为98．8％（656／664），手工PCR－RSSO为88．3％（733／830）。经χ^2检验，全自动半量PCR－RSSO与PCR－SSP的分型成功率无统计学差异，与手工PCR－RSSO有显著差异（P＜0．05）。结论：PCR－RSSO可识别HLA－I、Ⅱ共706个等位基因，覆盖WHO命名委员会2000年公布的36个等位基因的75．43％；对706个HLA等位基因的分型均为中－高分辨率，有分辨纯合子等位基因的能力；易长期保存书面的实验原始资料，即杂交条；具有成本低、劳动强度低、省时和DNA消耗量少等优点。PCR－RSSO适合于造血干细胞移植和建立造血干细胞及脐带血干细胞库的组织配型。

西藏珞巴族HLA-DRB1基因多态性

目的:检测西藏珞巴族HLA DRB1等位基因及基因型频率,并将其与18个人群的HLA DRB1频率进行比较,绘制系统发生树。方法:应用聚合酶链反应序列特异性寡核苷酸探针(PCR SSO)技术,对我国西藏南部林芝地区3代内无血缘关系的92个珞巴族健康个体进行了HLA DRB1位点的基因分型。采用不加权配对组算术方法(UPGMA)绘制系统发生树。结果:在92例珞巴族个体的184个等位基因中共检出11种HLA DRB1等位基因,其中HLA DRB1*04(27. 20% ),DRB*12(25. 50% )在珞巴族中最常见,共占珞巴族可检出等位基因的52. 70%;其他频率大于5%的等位基因还有DRB1*14(15. 20% ),DRB1*15(9. 80% )和DRB1*08(8. 20% )。结论:西藏珞巴族HLA DRB1等位基因分布与其他华人群体均存在很大的差异,显示其HLA等位基因频率分布的民族独特性;在遗传距离上珞巴族和藏族最近,这与民族学、历史学和社会学研究结果相一致。

人类白细胞抗原-DQB1与儿童十二指肠溃疡和幽门螺杆菌感染的相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原(HLA)-DQB1等位基因与儿童十二指肠溃疡(DU)和幽门螺杆菌(H.pylori)感染的遗传关联性。方法采用非同位素标记的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)杂交的方法,对上海地区汉族健康儿童80例、DU患儿58例的HLA-DQB1等位基因进行分型;并同时检测DU患儿H.pylori感染情况。结果在DU患儿中,HLA-DQB1×05031等位基因频率明显高于正常健康儿童(分别为:6.02%、0.63%,P<0.05,RR=9),而在H.pylori阳性和H.pylori阴性DU组之间差异无显著性。结论HLA-DQB1×05031与DU呈正相关,DU患儿与正常对照组儿童之间存在着遗传学的差异;虽然H.pylori感染是DU的重要致病因素,但HLA-DQB1×05031并不是通过H.pylori感染而影响DU的遗传易感性。

广西壮族强直性脊柱炎患者HLA-B_(27)亚型的研究

目的:对广西壮族强直性脊柱炎(AS)患者进行HLA-B27亚型检测并探讨其临床意义。方法:采用聚合酶链反应—序列特异性引物(PCR-SSP)法对广西壮族65例AS患者和260例健康体检者的HLA-B27进行检测,并对HLA-B27阳性的标本进行亚型分型。结果:AS组的HLA-B27阳性率明显高于对照组(P<0.01);两组的HLA-B27亚型均主要为B*2704和B*2705,两组间的HLA-B27亚型分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论:广西壮族AS与HLA-B27存在相关性;AS与HLA-B27各亚型的特异基因可能无关。