聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线技术在下呼吸道细菌鉴定中的应用

为探讨聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)技术在检测呼吸道菌群中的应用,本研究用支气管镜从慢性阻塞性肺病患者下呼吸道采集分泌液,提取细菌总DNA,以16S通用引物27F/1492R扩增16S rDNA全长,PCR产物经电泳、纯化后连接到pGEMT-Easy载体上,构建16SrDNA克隆文库。然后以16S rDNA V3区通用引物338F/518R扩增克隆文库,V3区PCR-HRM分析在罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR系统中进行,采用HRM基因扫描软件分析数据。根据不同HRM图型,挑选克隆株测序并鉴定菌株。结果显示,PCR-HRM技术可灵敏区分下呼吸道不同细菌16SrDNA V3区,根据HRM图谱可极大减少克隆菌株测序样本,提示PCR-HRM技术可作为一种快速、高通量、敏感、经济的菌群多样性检测方法。

基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术检测EV-A71 RNA及其与病毒3D聚合酶的相互作用

RNA荧光原位杂交(RNA-fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)技术利用荧光标记的核苷酸探针,通过互补链杂交,对细胞或组织中特定的RNA序列进行检测和定位。由于RNA-FISH产生的阳性信号较弱,需要结合特异性信号放大,提高信噪比。但传统信号放大技术的背景难以消除,无法定量且分辨率低,是RNA-FISH技术应用的巨大障碍。本文基于第3代杂交链反应(hybridization chain reaction version 3.0,HCR v3.0),利用一对分裂式探针消除非特异杂交背景,并引发荧光信号放大反应,建立了针对肠道病毒A71(enterovirus-A71,EV-A71)RNA的敏感、特异的FISH检测方法,并将该技术与蛋白免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测结合,通过高分辨率激光共聚焦成像,成功地在单个细胞水平上检测了EV-A71感染细胞后病毒RNA与其聚合酶3D蛋白的分布变化和相互作用情况,并对细胞中病毒RNA和3D蛋白进行定量。发现相较于传统定量方法,如逆转录定量聚合酶链反应和免疫印迹,新一代RNA-FISH技术在单个细胞水平上病毒RNA和3D聚合酶的表达情况与群体细胞检测的结果在趋势上有明显差异。这说明,基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术,可以克服群体细胞数量增减掩盖病毒组分变化的缺点,从而真实反映病毒在单个细胞中的变化。

逆转录-聚合酶链反应-酶联夹心杂交法检测呼吸道合胞病毒及其亚型感染

目的:建立一种呼吸道合胞病毒(RSV)及其亚型核酸检测方法并初步应用于临床,检测浙南地区RSV及其亚型的流行情况。方法:根据RSVG蛋白基因核苷酸序列设计引物和探针,通过逆转录-聚合酶链反应-酶联夹心杂交法(RT-PCR-ELSH)随机检测了浙南地区连续两年冬春季期间202例急性下呼吸道感染的婴幼儿鼻咽部分泌物中RSV及其亚型的病毒核酸;与病毒分离培养、直接免疫荧光法(DFA)、OligoDetect试剂盒比较探讨其临床实用性。结果:202例标本中RSV阳性123例,阳性检出率为60.9%,2002～2003年和2003～2004年冬春季分别为68.2%和52.6%;两个冬春季都以RSVA亚型为主,占78.9%,2002～2003年冬春季A亚型占RSV阳性标本中的76.7%,2003～2004年A亚型占82.0%;RT-PCR-ELSH阳性检出率与其他三种方法的阳性检出率差异无显著性(P>0.05)。结论:RT-PCR-ELSH法用于检测RSV及其亚型,是一种灵敏度高、特异性强,方便、快速的方法,非常适用于临床标本的大批量检测和流行病学调查;RSV是引起浙南地区冬春季婴幼儿急性下呼吸道感染的最主要的病原体,并以A亚型为主。

聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核杆菌的临床应用及其评价

目的 对聚合酶链反应 ( PCR) -微孔板杂交法检测结核杆菌的临床适用性和可行性进行评价。方法 收集 1130份临床标本 ,分别用抗酸染色、培养、PCR电泳及 PCR微孔板杂交法进行结核杆菌检测 ,并结合临床诊断和疗效观察对实验结果进行分析。结果 10 0份临床证实无结核病的体液标本经抗酸染色和 PCR电泳 ,分别有 1例和 2例假阳性 ,但经培养和 PCR微孔板杂交法未查出阳性 ;其余 10 30份高度怀疑含有结核杆菌的体液标本的检测结果 ,以 PCR微孔板杂交阳性检出例数最高 ( 481/ 10 30 ) ,其次为 PCR电泳 ( 40 6 / 10 30 )、培养 ( 36 5 /10 30 )以及抗酸染色 ( 2 5 6 / 10 30 ) ;χ2 检验结果显示 ,PCR微孔板杂交的结核杆菌阳性检出例数与其它三种方法比较均呈显著或极显著性差异 ( P<0 .0 0 83及 P<0 .0 0 17)。结论 PCR-微孔板杂交方法是特异、灵敏、准确、快速的结核杆菌检测方法 。

聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核分支杆菌的临床应用及其评价

目的:对聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核分支杆菌的临床适用性和可行性进行评价。方法:收集1130份临床标本,用抗酸染色、培养、PCR 电泳、PCR 微孔板杂交法分别进行结核杆菌的检测,并结合临床诊断和疗效观察对实验结果进行分析。结果:100份临床证实未含结核杆菌的临床标本,抗酸染色和 PCR 电泳分别有1例和2例假阳性;培养和 PCR 微孔板杂交法未查出阳性。1030份高度怀疑含有结核杆菌的体液标本的检测结果,以 PCR 微孔板杂交阳性检出例数最高(481/1030),其次为 PCR 电泳(406/1030)、培养(365/1030)以及抗酸染色(256/1030);x^2检测结果显示 PCR 微孔板杂交的结核杆菌阳性检出例数与其它三种方法比较均呈显著或极显著差异。结论 PCR-微孔板杂交方法是一种特异、灵敏、准确、快速的结核杆菌检测方法,具有广泛推广应用的价值。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

逆转录—聚合酶链反应—酶联夹心杂交法定量检测人IL-6mRNA

目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的逆转录—聚合酶链反应—微孔板酶联夹心杂交技术定量检测人IL-6mRNA的方法。方法:从人外周静脉血单个核细胞提取总RNA,进行RT-PCR扩增,PCR产物经热变性后与检测探针一起加入已包被捕获探针的微孔板内进行夹心杂交,用链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物系统检测杂交信号。结果:该方法检测IL-6mRNA的灵敏度明显高于逆转录—聚合酶链反应—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT-PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于细胞因子mRNA的定量检测。

用微孔板杂交技术检测聚合酶链反应扩增产物

用微孔板杂交技术检测聚合酶链反应(PCR)扩增产物是将PCR技术和类似ELISA的技术结合起来的一种方法,它使PCR的敏感性提高100倍,通过探针杂交使其更具特异性,并可通过酶联检测系统使结果客观化,同时又具有简便、快速的特点,在基础和临床应用上前景看好。

聚合酶链反应及斑点杂交技术对喉尖锐湿疣复发原因的探讨

用通用引物介导的聚合酶链反应及其产物斑点杂交技术,对复发性喉尖锐湿疣组织中人乳头状瘤病毒(HPV)相关序列进行了检测和分型,结果例3次手术标本均为HPV6型,表明隐性感染和/或原发病灶未彻底清除,可能是喉尖锐湿疣复发的重要原因,因此建议手术时适当增大切除范围。

聚合酶链式反应联合反向斑点杂交法对于β-地中海贫血的筛查价值

目的:对β-地中海贫血(βthalassemia,β-TM)患者的进行基因分析,了解β-TM患者的基因突变类型。方法通过全血细胞分析,筛查出MCV﹤80fL,MCH﹤27pg,Hb﹤110g/L的贫血患者,然后进行血红蛋白电泳分析,通过诊断标准:MCV﹤80fL,HbA2>3.2%,HbF>3.1%为阳性患者219例,进一步应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)结合反向斑点杂交技术(reverrsedotblot, RDB),检测其基因突变类型。结果进行基因检测的219例患者中,男性127例,女性92例,进行PCR-RDB法的基因诊断共检出5种突变基因: CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C-T)、TATAbos-28(A-G)、CD17(A-T)、CD14-15(+G)。其中以CD41-42(-TTCT)突变类型占首位,IVS-Ⅱ-654(C-T)突变类型次之。结论PCR-RDB法的基因诊断相对敏感度,特异性高以及诊断的阳性率高。

聚合酶链反应和反向斑点杂交技术检测人乳头瘤病毒感染

目的:研究聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和反向斑点杂交(reverse dot blot,RDB)技术在人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染检测中的情况,进一步研究其应用价值。方法:收集2013年3月至2015年6月宫颈癌、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变三种类型疾病共320例脱落细胞标本,采用PCR和RDB杂交技术对HPV基因型进行检测,分析检测数据。结果:在宫颈癌、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤变的感染中HPV单基因型感染均多于多重基因型感染,但不同疾病中单基因型感染患者比率差别不明显,分别为82.50%、84.06%、84.30%;不同疾病中多重基因型感染患者例数分别为17.50%、15.94%、15.70%,两种类型感染情况比较,差异无统计学意义(P>0.05);320例标本中检测出的210例阳性标本进行分型,反复检验后数据显示HPV16为最主要的感染基因型。结论:PCR和RDB技术是HPV基因型检测的有效方法,也是关于进行HPV感染防治的有效检测指标。

聚合酶链反应-芯片杂交法检测乙醛脱氢酶2亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性实验的体会

我国每年因药物不良反应的住院人数高达250万，死亡人数约20万。相关研究结果表明，药物不良反应占全球主要死亡原因的第4～6位。药物代谢相关的酶、药物结合相关的受体、药物转运相关的膜通道、信号传导相关蛋白的编码基因的遗传变异与药物不良反应密切相关[1]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的脱氧核糖核酸序列多态性，是决定个体差异的最主要的遗传基础之一，SNP的存在导致生物个体之间大量功能蛋白不同，导致了对药物反应的千差万别[2，3]。而基因芯片技术对患者遗传分子诊断起着重要的作用。因此，规范的技术操作是保证基因芯片合格率的基础。

聚合酶链反应技术应用进展

全血不需分离细胞 ,将红细胞低渗溶解 ,直接取细胞胞溶物进行PCR基因分型 ,结果可靠 ;血管紧张素转换酶 (ACE)等位基因缺失在缺血性心肌病中有重要意义 ,而ACE基因插入 /缺失 (I/D)多态性检测由FerencSomogyVari提出的迅速PCR ,在Lightcycler仪器上采用荧光标记的寡核苷酸杂交探针能准确快速的进行基因分型 ;DNA模板无需变性 ,进行HBVDNA扩增。

HLA-B27聚合酶链反应体系的建立和初步临床应用

目的:建立一种快速、廉价、特异性高、准确检测强直性脊柱炎(AS)患者人类白细胞抗原B27(HLA-B27)的方法。方法:选择人类白细胞抗原B27蛋白基因组保守区域设计上游引物,下游引物,优化PCR反应体系。对450例AS疑似标本和50例健康体检标本同时采用流式细胞技术(FCM)检测对照其结果进行方法学评价。结果:(1)成功的构建了PCR反应体系。(2)450例AS疑似标本聚合酶链反应(PCR)法检出HLA-B27阳性247例,阳性率54.89%,流式细胞技术检出HLA-B27阳性250例,阳性率55.56%,50例健康体检标本HLA-B27两种检测方法均为阴性。两者复合率达98%以上,对20例阳性标本进行多次PCR实验,重复性一致,未见批间和批内差异。(3)初步临床应用证实该方法结果准确、灵敏度高。结论:采用聚合酶链反应检测HLA-B27的方法灵敏度高、特异性强、操作简便、廉价、快速,更适合临床检验诊断的要求。

DNA体外扩增技术的突破——聚合酶链反应(PCR)的发展与应用

过去,人们为了从生物材料中获得某一段特定的DNA(基因)顺序或者进行其顺序分析或鉴定,需要经过非常繁琐的步骤并耗费大量的时间,而且往往还会由于所从事样品的复杂性、不均一性或含量太少而无法达到目的。最近由美国Cetus公司人类遗传部的一个小组研究和发展起来的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)