聚合酶链反应-直接测序法在强直性脊柱炎患者HLA-B27检测中的应用

目的探讨聚合酶链反应-直接测序法(polymerase chain reaction sequence-based typing,PCR-SBT)检测人类白细胞抗原B27(human leukocyte antigen B27,HLA-B27)在强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)临床诊断中的价值。方法应用PCR-SBT法和临床常用的IMS-ELISA法对120例疑似AS患者外周血进行HLA-B27检测。以SPSS17.0软件的配对χ2检验和受试者工作特征曲线下面积对两种方法检测HLA-B27在AS诊断中的价值进行评价。结果 120例疑似AS患者中,PCR-SBT和IMS-ELISA法HLA-B27检测阳性率分别为45.83%(55/120),37.50%(45/120)。两种方法检测HLA-B27有统计学差异(P=0.031)。PCR-SBT法敏感度和特异度分别为96.36%,96.92%;IMS-ELISA法的敏感度和特异度分别为69.09%,89.23%。两者的AUC分别为0.966和0.792。结论与传统的IMS-ELISA法相比,在AS的临床诊断中PCR-SBT法检测HLA-B27的敏感度和特异度更高,方法更优。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

基因测序技术与聚合酶链反应(PCR)技术在医学检验中的应用分析

比较基因测序技术与聚合酶链反应(PCR)在结核病诊断中的效能,为结核病的规范化诊断提供循证依据。方法 前瞻性随机对照研究。纳入2022年6月-2023年6月住院的100例疑似结核病患者,随机分为PCR组和测序组,每组50例。分别采用PCR和基因测序技术对痰液等临床标本进行检测,判断结核分枝杆菌阳性。比较两组的诊断敏感性、特异性、准确性及检测时间。结果 测序组诊断结核病的敏感性、特异性、准确性分别为96.00%、98.00%、97.00%,均高于PCR组的84.00%、90.00%、87.00%,差异均有统计学意义(P<0.05)。测序组的检测时间为(4.5±1.2)h,短于PCR组的(6.8±1.6)h(P<0.05)。结论 基因测序技术在结核病诊断中的敏感性、特异性、准确性及检测速度方面均优于PCR方法,有望成为结核病诊断的"新贵"。将基因测序技术规范化应用于结核病的常规诊断,有助于结核病的早期发现和精准治疗,对控制结核病流行,降低疾病负担,保障人民健康具有重要意义。

北京地区人群HLA-A、B、DRB1的聚合酶链反应-直接测序分型研究

目的调查北京人群人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen,HLA)-A、B、DRB1的基因多态性,获得完整准确的遗传学数据。方法应用聚合酶链反应-直接测序分型(polymerase chain reaction se-quence-basedtyping,PCR-SBT)法对北京地区人群中618名健康无关个体进行HLA-A、B、DRB1基因座高分辨分型。结果检出HLA-A、B、DRB1的基因型数和等位基因数分别为199和84、366和143、286和122,这3个基因座分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。结论从基因水平分析了北京地区HLA-A、B、DRB1基因座的群体分布特征,提供了一套比较完整准确的HLA-A、B、DRB1等位基因频率、基因型频率,为器官移植的供体选择、法医学个体认定、HLA与疾病相关性及人类学等研究提供了重要的参考数据。

套式聚合酶链反应直接测序法分析产超广谱β-内酰胺酶菌TEM全基因

目的 建立套式聚合酶链反应直接测序方法分析产超广谱 β 内酰胺酶菌TEM全基因 ,以便TEM分型和发现新的亚型。方法 根据Genbank核酸数据库已登录的TEM各亚型序列 ,在保守区自行设计 4条引物 ,分A、B两段半套式重叠扩增TEM全基因 ;并对A段作正向测序 ,B段作反向测序。结果 大肠埃希菌TEM 1、TEM 2、TEM2 6等 3种典型菌株均成功扩出A、B两段 ,产物直接测序波峰锐利 ,信噪比值高。该三株菌测得的序列与已在Genbank登录的序列一致。

聚合酶链反应联合直接基因测序快速诊断感染性眼内炎的研究

目的探讨利用聚合酶链反应(PCR)联合直接基因测序技术检测感染性眼内炎的可行性及有效性,为感染性眼内炎患者的快速诊断寻求一种新的检测方式。方法对我院2005年10月至2006年10月手术治疗的感染性眼内炎患者47例47眼,手术取材进行PCR联合直接基因测序检查并与细菌涂片、细菌培养、真菌培养、厌氧菌培养检查结果对比。结果PCR联合基因诊断方法检查时间较传统方法耗时少。PCR病原菌检测阳性率高,为25例,25例阳性者中经直接基因测序出病原体类型19例。与病原体培养相比,敏感性为91.67%,特异性为77.14%,Kappa值为0.577。结论对于感染性眼内炎,PCR联合直接基因测序技术是一种快速﹑有效的临床检查技术。

聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究

目的应用PCR-DNA测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌分离株KatG基因突变,评价其在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性方面的应用价值。方法47株耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株及30株结核分枝杆菌敏感分离株用PCR-DNA测序技术检测KatG基因突变。结果47株耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中,有31株KatG基因检出有突变,突变检出率为66.0%(31/47);30株结核分枝杆菌敏感株检出1株KatG基因突变。结论PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变,有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测。

无精子症患者Y染色体序列标签位点-聚合酶链反应与二代测序检测的比较

目的观察无精子症患者Y染色体序列标签位点-聚合酶链反应(STS-PCR)与二代测序(NGS)检测的差异。方法对133例无精子症患者,采用STS-PCR检测Y染色体AZF微缺失的15个STS位点,包括AZF a区的sY84/sY86、AZF b区的sY124/sY127/sY128/sY133/sY134/sY143/sY1192、AZF c区的sY152/sY239/sY242/sY254/sY255、AZF b/c区的sY145,同时采用NGS检测Y染色体基因组拷贝数变异(CNVs),并统计分析两种检测方法的差异。结果133例无精子症患者中,Y染色体AZF微缺失异常17例(12.78%),其中缺失14个STS 1例,占5.88%;缺失12个STS 3例,占17.65%;缺失11个STS 1例,占5.88%;缺失6个STS 1例,占5.88%;缺失5个STS 1例,占5.88%;缺失4个STS 2例,占11.76%;缺失2个STS 1例,占5.88%;缺失1个STS 7例,占41.18%。Y染色体CNVs异常12例(9.02%),其中既重复又缺失3例,占25%;重复(dup)4例,占33.33%;缺失(del)5例,占41.67%。Y染色体AZF(15个STS)微缺失的结果与CNVs缺失结果相比,差异有统计学意义(P<0.05),而Y染色体AZF(经典6个STS)微缺失的结果与CNVs缺失结果相比,差异无统计学意义(P=0.357)。结论STS-PCR和NGS互有补充,前者不能检测出重复,后者可能漏检小片段缺失。在无精子症遗传因素的实验室检查中,可以考虑采用NGS作为筛选,而采用STS-PCR作为验证。

全血改进线性指数聚合酶链式反应用于焦磷酸测序检测基因多态性

焦磷酸测序是目前基因多态性检测的主要方法之一,但是其前期的样本制备工作较为繁琐,限制了其在临床检测中的应用。为了简化焦磷酸测序的流程,本研究根据不对称PCR原理,改进了线性指数聚合酶链式反应(LATE-PCR)的引物设计方法,增加过量引物的长度和浓度,并结合全血直接扩增技术,建立了基于普通r Taq聚合酶和高p H缓冲液(Hp H Buffer)的全血改进LATE-PCR(Improved LATE-PCR,im LATE-PCR)方法。考察了方法的最优扩增体系、血液抗凝剂对其影响以及全血模板量。采用单管、一步法直接扩增出单链测序模板,成功地对24例临床血样的乙醇脱氢酶基因多态性进行了检测,检测结果可用于指导临床个体化用药。24例样本的基因型分别为ADH1B位点AA纯合6例、AG杂合14例、GG纯合4例;ADH1C位点GG纯合20例、AG杂合4例、AA纯合0例。

荧光聚合酶链反应–毛细管电泳法与Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶基因启动子突变状态对比分析

目的对比分析荧光聚合酶链反应-毛细管电泳(polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE)法及Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)基因启动子突变的敏感度、特异度及一致性,为临床检测提供方法学依据。方法收集2017年11月至2019年11月首都医科大学宣武医院265例胶质瘤标本及临床病理资料,分别采用Sanger测序法与荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变。结果TERT基因启动子突变与年龄、组织学分型和WHO分级均显著相关(P<0.05)。Sanger测序法与荧光PCR-CE法的TERT基因启动子突变检出率分别为52.8%(140/265)及51.3%(136/265),敏感度和特异度分别为96.4%和99.2%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.955)。Sanger测序法检出TERT C228T突变103例(38.9%),荧光PCR-CE法检出99例(37.4%),敏感度和特异度分别为95.2%和99.4%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.952)。Sanger测序法和荧光PCR-CE法均检测出TERT C250T突变37例(14.0%),符合率为100.0%,具有较高一致性(Kappa=1.000)。结论荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变率与Sanger测序法相当,敏感度、特异度及一致性均较高,且操作相对简便快速。

实时荧光定量聚合酶链反应在HBV YMDD基因变异检测中的应用

目的以DNA测序法为标准,探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测乙型肝炎(下称乙肝)病毒YMDD基因变异的敏感性和特异性。方法选取68例乙肝患者经拉米夫定治疗前及治疗9个月后其血清采用荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异,并随机选取10例(5例实时荧光定量PCR提示YMDD变异;5例提示未变异)慢性乙肝患者做DNA测序,分析二者的检测结果。结果拉米夫定治疗前HBVDNA的载量,两组相比差异无统计学意义(P>0.05),9个月后YMDD的变异率为14.7%(10/68);YMDD变异型组HBV DNA无l例阴转,YMDD野生型组HBV DNA阴转率为79.3%(46/58),差异有统计学意义(P<0.01);10例测序法所测结果与实时荧光定量PCR完全相符,总符合率为100.0%。结论实时荧光定量PCR技术联合检测HBV DNA及YMDD变异具有很好的临床应用前景。

荧光聚合酶链反应检测血液标本快速方法的建立及其在ADRB1单核苷酸多态性分型中的应用

目的:建立一种荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测血液标本的快速方法,并将其应用到ADRB1(1165G>C)基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型检测中。方法:建立可直接利用血液样本进行荧光PCR扩增法,与传统血液样本的基因SNP检测方法不同,本所建立的方法无需进行血液基因组DNA的提取。选取1051份临床乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝全血样本,利用本研究建立的采用血液标本直接扩增的荧光PCR方法,进行ADRB1的SNP分型,并将分型结果与Sanger测序法这一"金标准"进行对比,评估两者之间的符合率和一致性。结果:本研究建立的方法与传统DNA提取加荧光PCR方法相比,具有较好的扩增性能;与Sanger测序法相比,本研究建立的方法在ADRB1(1165G>C)基因SNP分型检测中的总体符合率达到98.98%,Kappa一致性系数达到0.971,具有较高的准确率。结论:与传统方法相比,本研究建立的方法可省略基因组DNA提取步骤,其操作简便、成本较低,且准确率高,适合在基因分型相关临床检验工作中推广和使用。

宏基因组二代测序在实体器官移植感染防控中的应用

器官移植已成为多种终末期疾病的有效治疗手段,但器官移植受者术后需长期服用免疫抑制药,导致免疫功能低下,使得细菌、病毒和真菌感染的发生率相对较高。以病原学培养、免疫学检测和聚合酶链反应为代表的传统微生物检测方法被广泛用于感染检测,但存在耗时长、需预先假定病原体等问题。宏基因组二代测序由于具有病原体检出率高、对病原谱检测全面的优点,近年来被广泛应用于器官移植领域的感染防控。本文就宏基因组二代测序技术在实体器官移植感染防控上的应用现状进行综述,以期对移植相关感染的诊断和治疗提供参考。

qPCR-HRM曲线分析技术与普通PCR加直接测序法检测胶质瘤EGFR突变比较

目的:比较实时聚合酶链反应-高分辨率融解(qPCR-HRM)曲线分析技术和普通PCR法加直接测序法检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,探讨适用于临床的EGFR基因突变检测方法,为胶质瘤患者术后放射、化学治疗及预后判断研究提供可靠的依据。方法:用普通PCR加测序法与qPCR-HRM曲线分析技术检测胶质瘤患者EGFR基因突变类型,检测结果比较采用卡方检验。结果:两种方法检测EGFR外显子19基因突变结果比较差异无统计学意义,且qPCR-HRM曲线分析技术比直接测序法更快捷、灵敏。结论:与直接测序法相比,qPCR-HRM曲线分析技术可能更适用于临床检测胶质瘤患者标本EGFR突变性质。

宏基因二代测序技术在社区获得性肺炎病原体检测中的应用进展

社区获得性肺炎(CAP)是常见的感染性疾病之一。其流行病学特征因宿主和免疫状况而异,病原谱也随着时间和空间分布而迁移。准确及快速识别病原体,开展精准治疗,是提高该病治愈率的关键。常规检测方法包括培养法、抗体及抗原检测、聚合酶链反应(PCR)等,但均具有识别缓慢、检出率低等缺陷,从而延误临床治疗时机。宏基因二代测序技术(mNGS)主要通过核酸提取、PCR扩增、文库构建等步骤对标本中所有微生物进行测序,同时利用大量的生物分析鉴定出病原体。与常规检测方法不同,mNGS具有迅速识别、全方位覆盖、灵敏度高等优点,在临床诊断中逐渐被选用。如今,mNGS已在CAP的诊疗中占据着越来越重要的地位,特别是在一些少见及新型病原微生物的检测上,并对特殊人群的病原体检出也具有一定的优势。然而,mNGS作为一种新型检测手段仍存在一些不足之处,例如,检测结果判读无统一的标准、结果受患者遗传物质影响较大、检测成本高等。将来可通过改进检测前标本的预处理、降低检测成本、简化检测后的结果判读对该技术进行优化,以便全面推广mNGS在临床中应用。

靶向二代基因测序协助诊治军团菌肺炎1例

报道来自天津医科大学朱宪彝纪念医院重症医学科的1例老年男性患者,既往有慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)、冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)、陈旧性心肌梗死及心功能不全病史,本次主因“咳嗽喘憋2 d”于2023年8月26日入院。入院初步诊断考虑重症肺炎等,入院伊始予以经验性抗感染治疗,但效果欠佳,患者病情恶化,需气管插管和机械通气。完善常规相关微生物化验,无明显阳性结果,因此笔者及时进行肺泡灌洗液的靶向二代测序(targeted next-generation gene sequencing,tNGS),并在第一时间确诊为嗜肺军团菌肺炎,随后采用莫西沙星进行抗军团菌针对性治疗,患者最终痊愈。目前军团菌的分离培养阳性结果仍是诊断军团菌感染的金标准,但军团菌的生长条件苛刻,且培养步骤烦琐、周期长,往往难以获得阳性结果。在本例中,常规病原学检测未能提供关键线索,笔者依据经验性判断,并及时运用tNGS技术,最终得以明确诊断,使患者得到及时、准确、有效的诊治,最终病情转危为安。tNGS技术是临床医生诊断治疗感染性疾病的又一有效利器。

神经纤维瘤病Ⅰ型患者HLA-DRB1位点等位基因的测序分型

目的 进行神经纤维瘤病Ⅰ型患者的HLA DRB1位点等位基因高分辨率测序分型 ,探讨HLA与神经纤维瘤病发病之间的关系。方法 应用聚合酶链反应 直接测序方法 (PCR SBT) ,对 3 0例神经纤维瘤病Ⅰ型患者及 10 8例正常人进行HLA DRB1位点等位基因分型。结果 神经纤维瘤病Ⅰ型患者HLA DRB1 0 40 6位点等位基因以较高频率出现 ,与对照组比较差异有显著性。结论 HLA DRB1位点等位基因频率在神经纤维瘤病Ⅰ型患者和正常人之间分布不同。

应用于组织病理学中的聚合酶链式反应技术

应用于组织病理学中的聚合酶链式反应技术蔡豪斌（广西桂林医学院生物工程研究所桂林市５４１００１）由于聚合酶链式反应基因扩增技术的出现，对组织标本的分子遗传学研究变得相对直观。组织病理学家开始对大量保存的组织病理学标本进行分子水平的分析研究。本文将对应用...