应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应对鲍曼不动杆菌进行同源性分析

目的了解临床不同来源的鲍曼不动杆菌是否存在同源性,判断其是否存在耐药菌株的克隆播散,追踪其在医院交叉感染的可能途径,以便有效防控鲍曼不动杆菌在医院中传播。方法收集2012年10月至2013年6月临床分离的73株多重耐药鲍曼不动杆菌,用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)对菌株进行同源性分析。结果 73株多重耐药鲍曼不动杆菌经ERIC-PCR分型分为8个基因型,分别用A、B、C、D、E、F、G、H表示,其中A型31株,B型15株,C型12株,D型8株,E型3株,F型2株,G和H型各为1株。A型为主要的流行株,分布在多个不同的科室。重症监护室(intensive care unit,ICU)分离的菌株存在6个基因型;骨科系统病区存在4个基因型;急诊科有5个基因型;内科发现有6个基因型;外科发现3个基因型。ICU病房环境物体表面共分离出4株鲍曼不动杆菌,其中9号和10号菌株来自于不同患者的床旁,12号和13号来自于护理站电脑键盘。结论临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌存在多个基因型。多重耐药鲍曼不动杆菌存在时间和空间的聚集性。

蝎毒对人肝癌Bel-7404细胞端粒酶活性的影响

目的 :观察蝎毒 (BMK)对人肝癌Bel 740 4细胞端粒酶活性的影响。方法 :不同浓度的BMK处理体外培养的人肝癌Bel 740 4细胞 72h ,聚合酶链反应 端粒重复扩增 (PCR TRAP)法测定端粒酶活性 ,四甲基偶氮唑盐比色 (MTT)法测定细胞增殖抑制。结果 :BMK可抑制Bel 740 4细胞端粒酶活性 ,随BMK浓度增大 ,端粒酶活性抑制增强。MTT结果显示BMK抑制Bel 740 4细胞增殖且抑制有浓度依赖性。结论 :端粒酶活性的抑制可能是BMK发挥抗癌活性的作用机制之一 。

一种检测端粒DNA重复序列相对长度的新方法—PCR法

目的 :为了观察补肾益精方药对端粒DNA重复序列长度的影响 ,创建一种新的简便的测定端粒DNA重复序列相对长度的方法。方法 :其原理是端粒DNA重复序列越长 ,其扩增产物越多 ,反之就少。根据端粒DNA重复序列 ,设计合成特殊的引物 ,引物 1为 5′CCCTAA3′ ,引物 2为 5′ ,TTAGGG3′ ,同时使用Taq和PfuDNA聚合酶 ,对端粒DNA重复序列进行PCR扩增。结果 :琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,端粒DNA重复序列得到扩增 ,λDNA对照没有扩增。结论 :端粒DNA重复序列确实得到了扩增 ,创建的此方法获得了成功。

规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响

目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。

端粒酶检测在31例胸腹水诊断中的意义探讨

目的 探讨端粒酶检测在胸腹水脱落细胞诊断中的临床意义。方法 采用聚合酶链反应 端粒末端重复序列 (PCR TRAP)技术结合ELISA法检测胸腹水脱落细胞的端粒酶。结果 在恶性胸腹水中端粒酶阳性率显著高于染色体多倍体检查的阳性率 (P <0 0 1)。结论 胸腹水端粒酶检测可提高单纯细胞学检查的敏感性、特异性 ,在恶性肿瘤的诊断上为临床提供依据。

上皮性卵巢肿瘤端粒酶活性及其各亚单位基因表达的研究

目的:探讨端粒酶及其亚单位(hTERT、TP1、hTR)在卵巢癌发生和发展中的作用,研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测66例卵巢上皮性肿瘤及10例正常卵巢组织端粒酶不同亚单位基因的表达情况,应用端粒重复序列扩增技术(telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP)检测其中45例卵巢上皮性肿瘤及9例正常卵巢组织端粒酶活性。结果:1)恶性、交界性卵巢肿瘤组织中端粒酶阳性检出率分别为83.33%(25/30)、71.43%(5/7),两组间无显著性差异(P>0.05),而良性上皮性卵巢肿瘤及正常卵巢上皮中未检测到端粒酶活性,与前两组之间均有显著差异(P<0.001);2)RT-PCR定性检测发现hTR和TP1mRNA在检测的各组组织中均有表达,而hTERTmRNA主要在上皮性卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中表达,二者间hTERTmRNA表达的差别无统计学意义(P>0.05),而与良性及正常组织hTERT表达有显著差异(P<0.001);3)端粒酶活性与hTERT亚单位表达明显相关(P<0.001),而与hTR和TP1亚单位表达无明显相关性(P>0.05)。结论:端粒酶与卵巢癌发生发展过程密切相关;hTERT表达与端粒酶活性密切相关,并可能参与端粒酶的活性调节,hTERT的表达有望成为上皮性卵巢癌的诊断指标。

端粒酶活性在非小细胞肺癌不同组织细胞中表达的研究

目的 对比研究端粒酶活性在非小细胞肺癌癌组织、癌旁组织、血液及痰液中的表达 ,以了解其临床意义。 方法 应用聚合酶联反应 -端粒重复序列扩增法 (PCR -TRAP)检测30例肺癌手术患者癌组织、癌旁组织、血液及痰液中的端粒酶活性 ,并以25例肺部良性疾病手术患者为对照组。结果 肺癌患者肺癌组织端粒酶活性阳性率83.3% (25/30) ,癌旁组织端粒酶活性阴性 ,外周血中端粒酶活性阳性率33.3 % (10/30) ,痰液标本中端粒酶活性阳性率56.7% (17/30)。对照组正常肺组织标本和外周血中端粒酶活性均阴性 ,痰液标本中端粒酶活性阳性率24.0% (6/25) ;两组病变组织、血液和痰液中端粒酶活性阳性率的差别均有显著性意义 (均P<0.05)。 结论 (1)非小细胞肺癌患者在肺癌组织、血液及痰液中均有端粒酶活性表达 ,其活性表达强度依次为肺癌组织、痰液、血液。 (2)痰液中端粒酶活性检测对肺部良恶性疾病的鉴别具有一定的诊断意义。

胸腺瘤组织中端粒酶活性检测的意义

目的:观察胸腺瘤组织及瘤旁组织端粒酶的活性,探讨其临床意义。方法:用改良的TRAP法检测18例侵袭性胸腺瘤、39例非侵袭性胸腺瘤和瘤旁组织以及20例正常胸腺组织端粒酶活性,用Tecan酶免分析仪连续测定其450-630nm的OD值。结果:18例侵袭性胸腺瘤及其瘤旁组织端粒酶阳性率及活性强度OD明显高于非侵袭性胸腺瘤。结论:端粒酶的检测有可能作为判别胸腺瘤良、恶性的新指标。

产金属β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的相关整合子和同源性分析

目的调查我院2010年1月—2010年12月临床分离的产金属β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药性、同源性、金属酶基因型及相关整合子。方法收集我院住院患者临床分离非重复对碳青霉烯类抗生素不敏感的肺炎克雷伯菌16株;乙二胺四乙酸(EDTA)协同实验筛选产金属β-内酰胺酶菌株;采用PCR法扩增金属酶和3类整合子基因,测序确定金属酶基因型;应用肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)分析产酶菌株间的同源性;琼脂倍比稀释法进行常用抗菌药物敏感性实验。结果 16株对碳青霉烯类不敏感的肺炎克雷伯菌中EDTA协同实验阳性的有5株,PCR扩增测序有4株产IMP-8型金属β-内酰胺酶,其中3株携带的IMP-8基因位于I类整合子上;未检测到II、III类整合子和VIM、GIM、SIM、SPM、NDM金属酶基因。ERIC-PCR结果显示产酶株分为2种基因型,A型3株,均分离于呼吸内科重症监护病房患者的痰标本;B型1株。药敏实验结果显示:A型的3株对青霉素类、头孢菌素类抗生素、氨曲南及环丙沙星完全耐药,其中K2菌株对亚胺培南、美罗培南中介,但对阿米卡星敏感;K1、K4菌株对亚胺培南、美罗培南及阿米卡星耐药。B型的K3菌株除氨曲南外对其他β-内酰胺类抗生素均高水平耐药,但对阿米卡星及环丙沙星均敏感。结论该院呼吸内科重症监护病房存在产IMP-8型金属β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌克隆传播,且耐药基因位于I类整合子上,医护人员应予以高度关注,注意进行临床检测和监控,并及时采取有效措施。

微卫星DNA序列在人-鼠脐血移植模型中的应用

目的 评价微卫星 DNA序列在人 -鼠脐血异种移植中的应用价值。方法 采用 PCR扩增短串联重复序列 (PCR- STR)技术及克隆形成细胞体外培养方法 ,观察移植后受鼠体内的造血细胞植入情况、造血生长因子对其的影响。结果 1静脉输注 1～ 5× 10 7个 MNC/只鼠可使受鼠体内表达供者 DNA,而经腹腔注射不能建立人 -鼠移植模型。 2人脐血细胞移植 SCID小鼠可以重建小鼠造血功能 ,其表达水平与外源细胞因子的使用无关。结论STR- PCR分析可以从分子水平对移植物植入状态进行微量和准确的鉴定 ,该方法为人 -鼠脐血移植模型的鉴定提供了简便。

膀胱癌组织中端粒酶活性检测的意义

目的探讨膀胱癌组织端粒酶活性与膀胱癌病理参数的关系及其临床意义。方法应用改良的TRAP法对40例膀胱癌组织、20例膀胱癌癌旁2cm膀胱组织和10例正常膀胱组织进行端粒酶活性的检测,用Yecan酶免分析仪连续测定其450～630nm的OD值。结果40例膀胱癌组织端粒酶活性强度OD值为0.567±0.251。正常膀胱组织无端粒酶活性存在。癌组织端粒酶活性强度OD值高于癌旁组织OD值(P<0.01)。端粒酶活性强度OD值Ⅲ级>Ⅱ级>Ⅰ级(P<0.05),OD 值在膀胱癌中随分级的增加呈上升趋势。浸润性膀胱癌端粒酶活性OD值明显高于浅表性膀胱癌端粒酶活性OD值(P<0.01)。淋巴结转移的膀胱癌端粒酶活性OD值明显高于无淋巴结转移的膀胱癌端粒酶活性OD值(P<0.05)。复发膀胱癌端粒酶活性OD值明显高于原发膀胱癌端粒酶活性OD 值(P<0.05)。结论膀胱癌组织中端粒酶阳性率及端粒酶活性强度OD值显著高于正常膀胱组织。端粒酶阳性率与膀胱癌病理分级、临床分期、淋巴结是否转移以及是否复发无关。但端粒醇活性强度OD值与膀胱癌的分级、分期、淋巴结转移以及复发有关。膀胱癌各病理参数中端粒酶阳性率经统计学比较差异无显著性,用端粒酶活性强度OD值作为比较可能更能显示其真正的临床意义。

山乌桕叶片DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

为研究南方优良乡土彩叶树种山乌桕的遗传多样性,并为山乌桕种质培育研究提供技术参考。以山乌桕叶片为试验材料,对山乌桕ISSR-PCR反应体系进行优化,比较试剂盒法、改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和十二烷基硫酸钠(SDS)法对山乌桕叶片DNA的提取效果,并利用单因素试验和L 25(53)正交试验对DNA模板用量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、退火温度和循环次数进行优化。结果表明,试剂盒法和改良CTAB法均可获得较高浓度和质量的DNA,都是提取山乌桕叶片DNA的良好方法;山乌桕叶片ISSR-PCR反应体系中,DNA模板用量对扩增效果影响最大,2×Taq Master Mix添加量的影响最小;山乌桕叶片ISSR-PCR的最优反应体系为:总体积20μL,其中含20 ng DNA模板1.5μL、2×Taq Master Mix 8.0μL、引物浓度0.8μmol·L^(-1)。山乌桕叶片ISSR-PCR的反应程序为:94℃预变性5 min、94℃变性30 s、51.9℃退火45 s、72℃延伸90 s、40个循环,72℃延伸10 min、4℃保存。

长沙地区产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的分子流行病学特征

目的了解长沙地区多重耐药铜绿假单胞菌(PA)产金属β-内酰胺酶(MBL)菌株基因型和流行情况。方法收集该地区7所综合医院临床分离的PA,对菌株进行鉴定和药敏试验,采用EDTA协同试验、E-test MBL进行MBL表型筛选,聚合酶连反应(PCR)明确其基因型,肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行同源性分析。结果经EDTA协同和E-test MBL初步筛查,81株PA中仅10株为强阳性;PCR结果显示,18株PA MBL基因阳性,其中IMP-9型11株,IMP-1型1株和VIM-2型6株,未检测出SIM、SPM、GIM和NDM-1基因型。ERIC-PCR分型结果显示,12株产IMP PA存在多个型别,而6株产VIM-2菌株为同一型别。结论长沙地区多重耐药PA以IMP-9和VIM-2基因型最常见。

18株铜绿假单胞菌的耐药谱和ERIC-PCR分型

目的研究产金属β-内酰胺酶(MBL)的铜绿假单胞菌感染的菌株同源性和耐药谱。方法用纸片协同法筛选出产MBL铜绿假单胞菌株;琼脂扩散法检测MBL阳性株对10种抗菌药物的药敏结果;用肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)方法确定菌株之间的同源性。结果纸片协同法试验检测到18株MBL阳性菌株,它们对头孢噻肟、头孢曲松、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶完全耐药,对10种抗菌药物呈现7种耐药模式;ERIC-PCR结果显示,18株MBL阳性株呈现4种基因型,15株为同一基因型。结论该院ICU内产MBL铜绿假单胞菌在2005年第二季度出现暴发流行。

急性白血病细胞端粒结合蛋白2表达的研究

目的:研究人类白血病细胞株及原代白血病细胞中人端粒结合蛋白2(TRF2)的表达。方法:应用实时定量RT-PCR,检测白血病细胞株及原代白血病细胞中TRF2 mRNA的表达,应用Western Blot,检测TRF2蛋白的表达。结果:T淋巴系白血病细胞株的TRF2表达显著高于骨髓单个核细胞和髓系白血病细胞株。在原代白血病细胞中,M0和M1亚型患者白血病细胞TRF2的表达高于其他各亚型急性髓系白血病(AML)患者。结论:预后差的AML患者和T细胞恶性肿瘤细胞株高表达TRF2,提示TRF2高表达可能和白血病的预后有关。

REP-PCR分型法用于白假丝酵母菌群分析

目的运用Agilent生物分析仪对临床白假丝酵母菌进行重复序列(REP)-聚合酶链反应(PCR)分型,并分析其流行趋势。方法设计REP引物,进行PCR扩增,用DL7500 Labchip芯片在Agilent 2100生物分析仪上对产物做微流电泳,获得虚拟凝胶视图,再运用GelCompareⅡ软件对其DNA指纹图谱做聚类分析。结果白假丝酵母菌菌株指纹图谱相似度较高,>80%以上。被分析的100株临床株可分为9个基因型。结论REP-PCR的Agilent 2100同源性分析具有快速、易于操作、高重复性和高分辨率等优点,可广泛用于流行病学调查与研究。

青岛两所医院鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因及同源性分析

目的了解青岛市两所医院鲍曼不动杆菌(AB)耐药情况、分布特征,碳青霉烯酶基因携带情况。方法收集两所医院临床分离的145株(A院78株,B院67株)AB进行药敏试验,采用聚合酶链反应(PCR)扩增碳青霉烯酶基因,肠杆菌科基因间一致重复序列(ERIC)-PCR对菌株进行同源性分析。结果 A院AB对临床常用的16种抗菌药物普遍耐药,对头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低(3.85%),其次是米诺环素(16.67%),对其他抗菌药物耐药率均>73%。B院AB对常用的23种抗菌药物普遍耐药,对米诺环素和替加环素均不耐药,对阿米卡星和左氧氟沙星的耐药率分别为23.88%、38.81%,对其他抗菌药物的耐药率均>64%。两院所有菌株均携带OXA-51基因,A、B两院碳青霉烯耐药组OXA-23基因的携带率分别为86.76%(59/68),56.67%(34/60),差异有统计学意义(χ2=14.53,P<0.001);A院3株菌携带OXA-58基因,B院未检出OXA-58基因。145菌株共分为8个基因型,其中A型71株和E型37株,为主要流行株;A院主要流行A型(46.15%)和E型(41.03%),B院主要流行A型(52.24%)和C型(17.91%)。结论两所医院临床分离的AB耐药情况严重,且存在医院流行,OXA型酶OXA-23、OXA-51基因在介导AB对碳青霉烯类药物耐药中发挥重要作用。

大肠重复癌微卫星不稳定性研究

目的 探讨微卫星不稳定性 (MSI)在大肠重复癌与单发大肠癌中的变化规律。方法 PCR SSLP法对 38例大肠重复癌患者的 5 1例癌灶及对照 35例单发大肠癌分别进行 5个碱基序列位点MSI检测。结果 大肠重复癌中复制错误 (RER)阳性率为 5 2 .9% (2 7/5 1) ,对照组为 17.1% (6 /35 ) ,两组差异有非常显著意义 (χ2 =11.2 5 ,P <0 .0 1)。大肠重复癌组中 ,RER阳性与低分化、近端大肠密切关联。RER阳性组与阴性组在年龄、性别、是否伴有转移、Dukes分期上未见异常。结论 MSI在大肠重复癌的发生上起着重要作用 ,MSI可作为预测大肠重复癌发生的有用标志 ,对MSI大肠癌患者应警惕多重癌发生的可能性。

STR-PCR半定量检测嵌合体方法在异基因造血干细胞移植中的应用

目的:应用短串联重复序列-聚合酶链反应(STR-PCR)半定量方法检测异基因造血干细胞移植后供者细胞比例并探讨其临床意义。方法:给30例接受移植的患者行移植后嵌合体检测,采集外周血提取DNA,对9个STR位点行聚合酶链反应扩增,扩增完成后行聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影,再计算嵌合率。结果:30例患者均检测到供者细胞,24例达到完全嵌合(CC),6例形成混合造血(MC)。在移植后14 d,稳定植入的患者多数表现为CC。CC组的aGVHD发生率高于MC组,7例患者在复发前检测到嵌合率(donor cell,DC)下降,经相应免疫治疗后有3例达到CC。结论:监测异基因造血干细胞移植后嵌合率的动态变化过程,PCR-STR是一种简单经济的方法,可根据嵌合状态指导个体化免疫治疗,对患者的长期存活有重要意义。

75株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌ERIC-PCR菌种分型及其主要耐药机制研究

目的探讨碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌同源性及其主要耐药机制。方法收集临床标本946份,分离出碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌,采用琼脂稀释法进行体外药物敏感性试验;采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行耐药菌株同源性分析;筛选其金属β-内酰胺酶并测定主动外排系统表型来分析碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌的耐药性。结果共检测出75株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌;ERIC-PCR同源性分析显示75株菌株共分为8个型别,其中A型占34.7%(26株)、B型占22.7%(17株);75株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中有13株为产酶株,产酶率为17.3%;外排泵抑制剂MC207110可以使34株美罗培南耐药株的最低抑菌浓度(MIC)较单药时下降4倍或以上,占63.0%。结论本院分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌主要有两种类型,产生碳青霉烯水解酶和外排泵机制是碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌耐药的重要机制。