双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。

改良PCR-RFLP法检测MTHFR基因C677T 位点多态性

目的建立一种简便、实用、准确的检测5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T位点多态性的方法。方法在分析MTHFR基因C677T多态位点相关序列的基础上,设计1对特异性引物,通过聚合酶链反应扩增1个535bp的靶片段,该靶片段跨越MTHFR基因C677T多态位点,且在多态位点上游163bp处含有一个限制性核酸内切酶HinfI识别位点,该识别位点可作为后续HinfI酶切分型的内对照,PCR产物用HinfI快速消化,再用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物,得出相应的限制性酶切图谱用于判别基因型。结果可从限制性酶切图谱中明确判断各样品MTHFR基因C677T位点基因型,CC、CT、TT3种基因型样品的分型结果与基因测序完全吻合。采用本法检测了100例样品,检得MTHFRC677T3种基因型样品即CC、CT、TT的频率分别为0.59、0.35、0.06;C和T等位基因频率分别为0.765和0.235,符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=0.0723,P=0.965>0.05)。结论该方法由于PCR产物中含有HinfI酶切内对照序列,能克服传统PCR-RFLP法酶切不完全可能导致基因型误判的缺点,简便、实用、准确,适合一般实验室应用及流行病学调查。

HSP70-hom基因多态性与高原反应易感性的关系

目的 探讨热应激或热休克蛋白 70 hom (HSP70 hom)基因型与高原反应易感性间的关系 ,为发现和保护易感人群提供依据。方法 随机选取武警战士 2 2 9人 ,其中 5 6人有高原反应者为病例组 ,173人无高原反应者为对照组。应用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)分析方法 ,研究两组观察对象中HSP70 hom的基因型分布情况。结果 病例组HSP70 homA/A基因型的频率明显高于对照组 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论 HSP70 homA/A基因型的机体可能存在应激能力较弱的问题 ,这有助于在特定职业人群中发现和保护这些个体 ,为保障健康 。

重型抑郁症患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测

目的探讨北方汉族人群5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与重型抑郁症的关系。方法采用病例-对照研究。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测MTHFRC677T及A1298C基因多态性。结果 (1)对照组677TT基因型频率及T等位基因频率分别为13.16%和39.80%;1298CC基因型和C等位基因频率分别为1.32%和12.83%;(2)抑郁症组MTHFR677TT基因型频率(35.53%)明显高于正常对照组(13.16%)(P<0.001),677 T等位基因频率(57.24%)明显高于对照组(39.80%)(P<0.001)。(3)Logistic回归分析,C677T基因型与疾病的发生有关(P<0.001)。结论 MTHFRC677T基因变异与本组重症抑郁症发病有关,是其发病的危险因素;MTHFRA1298C基因变异与本组重症抑郁症发病无关联。

中国人群醛固酮合成酶基因T-344C位点单核苷酸多态性频率分析

目的研究醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C单核苷酸多态性(SNP)在中国人群中的分布。方法采用PCR-RFLP法对中国人群进行醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率分析比较。结果中国人群的醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344C基因型频率分布:TT型占64.5%,TC型占30.8%,CC型占4.7%;等位基因频率T占79.9%,C占20.1%。各基因型频率、等位基因频率与西班牙人、德国人、苏格兰人、日本人差异非常显著。结论醛固酮合成酶(CYP11B2)基因T-344CSNP频率的分布有明显的种族差异。

α_1-抗糜蛋白酶基因多态性与阿尔茨海默病相关性探讨

目的 :探讨阿尔茨海默病 (AlzheimerDisease,AD)患者中α1 抗糜蛋白酶 (AACT)基因的多态性及其与AD的相关性。方法 :利用聚合酶链反应 (PCR) 限制性片段长度多态性 (RFLP)技术 ,对 4 8例AD患者及 86例对照者的AACT信号肽基因进行分型 ,并进行AD与AACT信号肽基因多态性的相关分析。结果 :①AD病人AACT信号肽A/T基因型占 2 7 1% ,明显低于对照组的 5 1 2 % (P <0 0 1,RR =0 35 5 ) ,T/T占 6 0 4 % ,明显高于对照组的 37 2 % (P <0 0 1,RR =2 5 76 ) ,A/A占 12 5 % ,与对照组 11 6 %无显著性差异 (P >0 0 5 ,RR =1 0 86 )。②AD病人中AACT信号肽等位基因A的频率为 2 6 0 % ,T的频率为 74 0 % ,与对照组 (A37 2 %、T 6 2 8% )无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 :AD病人的AACT T/T可能与AD存在正相关 ;而AACT

PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性的实验条件研究

目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件.方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究.结果PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为:引物浓度为0.2μmol/L;Taq酶量为1.5 U;dNTP浓度为120μmol/L;Mg2+浓度为2.0 mmol/L.最经济有效的酶切体系为20μL体系中加4μL产物用2.5 U的酶消化9 h以上.结论最佳实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键.

PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性实验条件研究

目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件。方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究。结果 PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为:引物浓度为30umol/L;Taq酶量为5U;dNTP浓度为56μmol/L。最经济有效的酶切体系为20μl体系中加4μl产物用5U的酶消化9h。结论最佳的实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键。

PCR-RFLP法检测MTRR基因A66G多态位点的改进

目的对现有检测MTRR基因A66G多态位点的PCR-RFLP法进行改进,避免因Nde I酶切不完全可能导致的基因型误判。方法设计1对PCR引物,上游引物3′端倒数第3位含错配碱基,下游引物结合位置位于一个天然的Nde I识别序列(CATATG)72 nt之后,使用该对引物扩增包含MTRR基因A66G多态位点的靶序列,将多态位点相关的原序列AATRTG(R为多态位点碱基A/G)变为CATRTG,以便通过限制性核酸内切酶Nde I消化来甄别多态位点碱基具体为A还是G,多态位点下游315 nt处含有天然的Nde I识别序列作为内对照酶切位点,PCR产物用Nde I消化制作限制性酶切图谱以判断基因型。结果PCR可成功扩增预期大小为478 bp的靶片段,在用Nde I消化PCR产物制作而成的限制性酶切图谱中,凭借小于PCR产物的2种特征性酶切条带可明确判断各样品基因型,即便酶切不完全即出现PCR产物残留或酶切中间产物时,基因型的判断也不受干扰,分型结果得到基因测序支持。使用该法检测了100例样品,检得MTRR基因A66G多态位点3种基因型即AA、AG、GG的频率分别为0.57、0.34、0.09;A和G等位基因频率分别为0.74和0.26,符合Hardy-Weinberg遗传平衡(X^(2)=1.355,P=0.508)。结论本方法由于内对照酶切位点的引入,能克服传统PCR-RFLP法使用Nde I酶检测MTRR基因A66G多态位点酶切不完全可能导致的基因型误判。

AT1R 1166A/C和CYP11B2-344C/T基因多态性与湖南汉族原发性高血压的相关性

目的探讨血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)1166A/C和醛固酮合酶(CYP11B2)-344T/C基因多态性与原发性高血压(EH)的相关性。方法用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)对100例EH患者和100例体检健康者AT1R1166A/C和CYP11B2-344T/C基因多态性进行检测。结果 EH组AT1R 1166A/C AC型和C等位基因的频率高于健康对照组;AC基因型的血压值、TG,TC,LDL-C均明显高于AA基因型。HDL-C低于AA型CYP11B2各基因型频率和等位基因频率无显著性差异(P>0.05)。各组内等位基因T的频率高于等位基因C(P<0.05)。两基因联合分析显示,相对于AA-TT联合基因型,同时携带AC-CT联合基因型的人群患高血压的危险性增加了2.25倍。结论 AT1R 1166A/C多态性与EH易感性相关,CYP11B2-344T/C基因多态性与EH无关,携带AT1R 1166A C型基因以及AC-CT联合基因型的人群患高血压的危险性大。

血管紧张素转换酶基因多态性与白族脑血管病患者的相关性研究

目的研究血管紧张素转换酶(ACE)基因插入/缺失多态性与云南大理白族脑血管病患者的相关性。方法应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对73例白族脑血管病(ICVD)组患者(其中脑梗死40例,脑出血33例)和43例性别年龄相匹配的白族健康对照组进行ACE基因型检测和基因插入/缺失多态性分析;并进行ACE基因双向测序。结果(1)脑梗死组的DD基因型频率和D等位基因频率明显高于对照组(P<0.05);(2)脑出血组与对照组相比较,未发现DD基因型频率和D等位基因频率有明显差异(P>0.05);(3)脑血管组内伴高血压与不伴高血压,伴糖尿病与不伴糖尿病,伴血脂异常与血脂正常者相比较,未发现DD基因型频率和D等位基因频率有显著差异(P>0.05);(4)D等位基因和I等位基因其核苷酸序列和长度与国内外文献报道无明显差别。结论(1)ACE基因插入/缺失多态性与脑梗死的发生有关联性,DD基因型和D等位基因是脑梗死患者的高危因素;(2)ACE基因插入/缺失多态性与脑出血发生未发现有关联性;(3)脑血管病的其他相关危险因素如高血压,糖尿病,血脂与ACE基因多态性可能无关联;(4)ACE基因16内含子中一段287bp的插入片段造成I/D多态性。

肿瘤坏死因子-α基因多态性与支气管哮喘相关性研究

目的 探讨肿瘤坏死因子 -α(TNF-α) - 30 8基因多态性与中国汉族支气管哮喘 (BA)易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (PCR- RFL P)方法 ,检测 6 4例 BA患者及 80例健康对照者的TNF-α- 30 8基因多态性 ,用 L ogistic回归计算其比值比 (OR)及 95 %可信区间 (95 % CI)。结果 TNF-α- 30 8A等位基因在 BA组及对照组的频率分别为 2 0 .31%、8.75 % ,两组比较有显著性差异 ;OR值为 2 .389,95 % CI为1.14 8～ 5 .6 38。结论 TNF- α- 30 8基因多态性与中国汉族 BA易感性有关。

E-选择素基因多态性及血清可溶性水平与慢性HBV感染临床结局的关系

目的:探讨E-选择素(E-selectin)基因第2号外显子G98T和第4号外显子A561C多态性及血清可溶性水平与慢性HBV感染临床结局之间的关系.方法:从外周血中提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测367例慢性HBV感染者(其中慢性HBV携带者97例,慢性乙肝101例,肝硬化121例,肝癌48例)和281例健康对照者E-选择素基因G98T和A561C位点多态性,同时采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组可溶性E-选择素(sE-选择素)水平.结果:E-选择素A561C多态性中A/C+C/C基因型和C等位基因频率在肝硬化组与对照组相比差异有统计学意义(P=0.006,0.002).A/C+C/C基因型患肝硬化的风险是AA基因型的2.45倍(OR=2.45,95%CI:1.28-4.72).E-选择素G98T多态性中各基因型频率和等位基因频率在各病例组与对照组相比差异无统计学意义,但在肝硬化患者中,Child-pughB+C级与A级相比较,G/T+T/T基因型频率差异有统计学意义(P=0.034),G/T+T/T基因型发展到Child-pughB或C的风险是GG型的3.07倍(OR=3.07,95%CI:1.05-8.97).慢性乙肝组和肝硬化组血清sE-选择素水平明显高于对照组(P<0.01);在肝硬化组中,血清sE-选择素水平从Child-pughA级到C级明显降低(P<0.05);在各组中,C等位基因携带者血清sE-选择素水平明显高于A等位基因携带者(P<0.05).结论:E-选择素A561C基因多态性可能与慢性HBV感染后肝硬化的发生相关,并参与调控血清可溶性E-选择素的表达;E-选择素G98T基因多态性与慢性HBV感染后的临床结局无相关性,但可能与肝硬化的严重程度相关.

复合PCR-RFLP技术用于尖音库蚊复组抗性相关酯酶基因分子分型

目的应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测法,建立尖音库蚊抗性酯酶等位基因分型方法。方法根据尖音库蚊抗性酯酶基因保守区序列设计引物;提取单个蚊虫基因组DNA,采用PCR-RFLP分析的方法,对抗性酯酶等位基因分型。结果酯酶基因扩增片段长度为860 bp,经限制性内切酶酶切后,尖音库蚊抗性Est-β11纯合型有5条带(70、89、147、198和347 bp);Est-β2纯合型出现4条带(60、147、207和437 bp);Est-β11/Est-β2杂合型出现5条带;Est-βN纯合型出现3条带(147、207和506 bp)。结论PCR-RFLP方法能快速、有效地检测尖音库蚊抗性酯酶等位基因类型。

深圳市汉族人白细胞介素-6基因-174G/C多态性的调查研究

目的调查研究深圳市中国南方汉族人白细胞介素6基因-174G/C多态性的分布与血脂等指标的相关关系。方法应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析方法及测序法测定了138例中国南方汉族人白细胞介素-6基因-174G/C多态性,并结合血压、血糖、血脂、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等相关指标进行横断面研究。结果中国南方汉族人白细胞介素-6基因-174G/C多态性以G/G纯合子基因型为主,分布频率为136/138(98.55%),G/C杂合子基因型分布频率为2/138(1.45%),C/C突变基因型未发现,各基因型与总胆固醇、甘油三酯、血压、低密度脂蛋白等关系不明显,与高密度脂蛋白有一定的关联(P=0.035)。结论中国南方汉族人白细胞介素-6基因-174G/C多态性不明显,是否为代谢综合征的易感基因之一有待进一步研究。

中国汉族人群hGSTA1基因C-69T多态性分析

目的 研究中国汉族人群中人谷胱甘肽S 转移酶(hGSTA1 )C-69T基因多态性的分布。方法1 4 0例血样本来自中国2 5个省份的汉族人口,用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性方法检测hGSTA1 69位点的变异。结果 中国汉族人群GSTA1基因 69位点的野生型纯合子(CC)基因型的分布频率为75 .0 %,突变型纯合子(TT)基因型为0 .7%,杂合子(CT)基因型为2 4 .3 %;C及T两种等位基因的频率分别为87.1 %及1 2 .9%。结论中国汉族人群GSTA1基因呈多态性分布。

应用多重PCR-RFLP技术检测头发、口腔腭粘膜的ABO基因型

目的 探讨对头发、口腔腭粘膜等组织标本进行ABO基因分型的可行性。方法 应用多重聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (多重PCR RFLP)技术 ,检测 8例头发和 6例口腔腭粘膜标本的ABO基因型 ,标本的基因组DNA经 2对引物同时进行扩增 ,扩增后的产物同时用MspⅠ和KpnⅠ 2种限制酶进行消化 ,通过消化后产生的片段即可判断结果。然后将分析结果与血清学技术检测的ABO表现型和受检者血液标本的基因型进行比较。结果 14例标本共检出 6种ABO基因型 ,与表现型和血液标本的基因型结果完全一致。结论 该方法操作方便 ,重复性、稳定性好 ,可鉴定 15种基因型 ,应用于法医学鉴定具有可行性。

血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性与支气管哮喘的相关性

目的研究血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)基因多态性与支气管哮喘儿童发病的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术,对53例哮喘及35例正常对照组儿童PAF-AH第11外显子Ala379Val位点基因多态性进行分析。结果哮喘组患儿基因组型频率和等位基因频率与对照组比较均无显著性差异(P均>0.05)。结论PAF-AH第11外显子Ala379Val基因突变与儿童支气管哮喘发病无关。

脑出血患者脂蛋白脂酶基因PvuⅡ酶切多态性的观察

目的探讨脂蛋白脂酶基因PvuⅡ多态性与脑出血的关系。方法采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP),对55例脑出血患者和正常对照组58例脂蛋白脂酶基因PvuⅡ多态性分析。结果(1)正常对照组PvuⅡ等位基因频率分别为P+67.24%,P-32.76%;脑出血组PvuⅡ等位基因频率为P+63.63%,P-36.37%;脂蛋白脂酶基因PvuⅡ等位基因频率在脑出血组与正常对照组之间差异无显著性。(2)与正常对照组相比,脑出血患者组血清TG、LDL-c水平较对照组升高(P<0.05);脑出血患者组血清HDL-c、ApoAI水平较对照组降低(P<0.05)。结论脂蛋白脂酶PvuⅡ酶切多态性与脑出血无明显关联。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C基因G 73A位点的多态性与急性心肌梗死关系的探讨

目的探讨半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)基因外显子+73G/A(简称G73A)位点变异与急性心肌梗死(AMI)的关系;同时观察池州地区汉族AMI患者血浆Cys C浓度的变化。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法分析112例AMI患者和110名健康对照者全血DNA中Cys C基因G73A位点变异的多态性分布情况,同时检测AMI组和对照组血浆Cys C浓度。结果AMI患者血浆Cys C浓度明显低于对照组(P<0.05)。在AMI患者组中,G73A位点GG/GA/AA基因型频率分别为64.3%、28.6%和7.1%,G等位基因频率为78.6%;对照组G73A位点GG/GA/AA基因型频率分别为67.3%、28.3%和4.5%,G等位基因频率为81.4%,2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论Cys C水平的降低可能是AMI发病的危险因素之一;池州地区汉族AMI患者和正常人群中存在Cys C基因G73A位点变异的多态性,这个位点发生变异可能对AMI疾病的的发生不起主要作用。