激光技术在聚合酶链式反应微流控芯片中的应用

评述了激光技术在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)微流控芯片领域中的应用进展,包括激光技术在PCR微流控芯片微加工、微流体物理参数测量、温度循环控制以及芯片上在线产物检测(包括荧光实时定量/终点和毛细管电泳检测)中的应用。最后,展望了激光技术在未来基于PCR的微全分析系统(micro-total analysis system,μTAS)中的新应用。

微流控实时荧光聚合酶链式反应成像非均匀性的校正

综合参考标样法和定标校正法的思想,提出了一种用于校正微流控实时荧光聚合酶链式反应(PCR)系统荧光成像非均匀性的"多目标像素区域定标线性校正"算法,以提高其检测结果的准确性。以与PCR荧光标记物SYBR Green光谱特性相似的荧光素钠溶液为样本,检测了11种不同浓度的均匀荧光素钠溶液受激发射荧光信号的强度,分析了各个目标像素区域荧光强度和荧光素钠溶液浓度之间的线性响应关系,采用两点定标校正方法计算了CCD各个目标像素区域的校正系数矩阵。实验表明,3种浓度荧光素钠溶液的成像均匀度分别从校正前的71.28%、72.01%、70.73%提高到校正后的77.49%、80.07%、90.64%;微流控四腔芯片中相同浓度的DNA样品在PCR扩增阶段的Ct值相对标准偏差由校正前的4.38%、1.94%、3.31%减小到校正后的2.44%、0.79%、1.31%,显著提高了微流控实时荧光PCR检测结果的准确性。

液滴微流控系统在数字聚合酶链式反应中的应用研究进展

数字聚合酶链式反应（ PCR）技术近年来发展迅速。与以实时荧光定量PCR为代表的传统PCR技术相比，数字PCR技术显著提高了定量分析的精确度和灵敏度。数字PCR的快速发展与近年来微流控技术在数字PCR技术中的广泛应用有着密切的联系。早期的研究和商业化产品使用的是大规模集成流路微流控芯片，加工过程复杂且价格高昂。近年来，液滴微流控芯片被应用到数字PCR技术中，它可以在短时间内产生10^2-10^7个微液滴，每一个微液滴都是最多只含有一个目的基因片段的PCR反应器。 PCR扩增后，通过对单个微液滴的观察计数，就可以获得绝对定量的分析数据。本文综述了不同种类的液滴微流控系统在数字PCR技术中的应用，以及液滴数字PCR微流控芯片在生物、医药、环境等领域的应用。

微流控振荡流反转录聚合酶链式反应快速检测烟草花叶病毒

建立了一种基于毛细管的振荡流反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的微流控装置检测烟草花叶病毒(TMV)的新方法。根据TMV移动蛋白基因设计一对PCR引物,对粗提纯TMV颗粒直接进行RT-PCR。用0.025%小牛血清蛋白(BSA)对反应毛细管内壁进行静力学和动力学钝化,提高了PCR效率。在此微流控装置上进行RT-PCR,流速为70μL/min时,检出限为0.01μg cDNA;可以在17min内成功扩增出179bp的目的DNA片段。

连续流动式聚合酶链式反应微流控装置的实验研究

连续流动式聚合酶链式反应（PCR）微流控装置是以低热容量的软薄膜加热器为基础构建3个恒温带，以聚四氟乙烯毛细管微通道为PCR反应体系组建而成。报道了在毛细管微通道中小牛血清蛋白（BSA）动力学表面钝化对PCR扩增的影响，讨论了PCR混合物在毛细管微通道中的流动速度对PCR扩增的影响，在15min甚至10min内成功扩增了长度为249bp的人类β-肌动蛋白片断，扩增时间仅10—15min，而传统PCR仪则需1～2h。

微流控芯片电泳-多重聚合酶链反应法同时测定多个单碱基多态性位点

以微流控芯片电泳为检测平台,建立了多重PCR扩增法同时测定多个单碱基多态性(SNP)位点的方法。先通过PCR扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶消化成短片段,再将酶切反应产物与脱氧核糖核酸适配器(DNAadapter)相连;以连接产物为模板,分成两管,分别用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增;最后用微流控芯片电泳法分离PCR扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。以细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为检测对象,考察了各等位基因特异性引物之间的相互影响和扩增反应的特异性,采用微流控芯片电泳法成功测定了20名健康中国人的CYP2D6基因中5个SNP位点的基因多态性,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定结果完全一致。

硅-玻璃聚合酶链式反应微芯片对β-葡糖苷酸酶基因的扩增

聚合酶链式反应 (PCR)微芯片是基于微机电系统 (MEMS)制作 ,在微芯片上进行PCR反应 ,实现生物样品扩增的一项新技术 .介绍了硅 玻璃PCR微芯片的设计和制作、微反应腔的清洗和表面处理、借助外置温度控制系统进行PCR扩增反应以及扩增产物在琼脂糖凝胶电泳下的检测分析 ,实现了对 β 葡糖苷酸酶 (GUS)基因的有效扩增 ,扩增时间由原来的 90min缩短到现在的 37min .

连续流动式聚合酶链式反应芯片的设计进展

介绍了PCR的概念以及微型PCR芯片的优点,着重介绍连续流动式PCR(continuousflowPCR)芯片/微装置的一般原理、串行流动及其设计进展。

聚合酶链式反应微芯片系统用于微量生物样品的快速扩增检测

基于MEMS微加工技术设计和制作了一种集成微加热器和温度传感器的聚合酶链式反应(PCR)微芯片。PCR微芯片结构通过有限元模拟验证分析。该芯片在PCR扩增过程中具有良好的制热效率和热传递均匀性。在微型温度控制电路装置下进行热循环反应,芯片的温度起伏小于1℃/s,升降温速度分别达到5℃/s和3℃/s,30个热循环耗时30min。此系统已经用于GUS基因的扩增检测,获得了良好的结果,极大的缩短了热循环的时间,可用于微量生物样品的快速扩增检测。

聚合酶链式反应生物芯片/微装置技术在疾病诊断中的应用

聚合酶链式反应(Po lym erase cha im reaction,PCR)技术已经在分子生物学、疾病诊断等领域得到广泛应用。PCR生物芯片/微装置由于具有所需样品和反应混合物体积小、反应时间短、轻便等优点倍受人们关注。本文综述了PCR生物芯片/微装置在疾病诊断领域中的应用,并对其应用和发展作出了展望。

一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.

重组酶聚合酶扩增检测产志贺毒素大肠埃希菌的微流控芯片技术

采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),开发产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)的等温检测方法,结合圆盘式微流控芯片快速检测目标微生物。以stx1和stx2基因为靶点,设计和筛选适宜的RPA检测引物和探针序列,验证了19株STEC菌株(含9种stx基因亚型)和21株非STEC菌株,并采用人工污染的牛肉样品对集成化的微流控芯片进行评价。筛选出检测stx1和stx2基因的高特异性引物、探针组合,与美国农业部微生物实验室技术指南中STEC定量聚合酶链式反应(real-time polymerasechainreaction,real-timePCR)方法相比,目标基因检测的包容性和排他性均为100%。荧光RPA微流控芯片法在20 min内可同时进行32个反应,可检测STEC菌体灵敏度为9.5×10^(3)CFU/mL。根据GB 4789.6—2016《食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》的规定经增菌培养后在人工污染牛肉样品中可检测1 CFU/25 g的STEC污染,方法的相对正确度和相对检出水平均为100%。本研究开发了一种荧光RPA微流控芯片检测方法,可检测常见stx基因亚型STEC菌株,操作简单、反应速度快,适用于STEC的高通量快速检测。

一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片

构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片.应用多层软光刻技术,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料,盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片.芯片的大小与载玻片相当,可同时检测4个样品,每个样品通入芯片后平均分配到640个反应小室,每个小室的体积为6 nL.以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA为样品检测了该芯片的可行性.将样品稀释数倍后通入芯片,核酸分子随机分布在640个小室中并扩增.核酸分子在芯片中的分布符合泊松分布原理,当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于0.5个/小室时,则每个反应小室包含0个或1个分子.经过PCR扩增后,有模板分子的小室检测结果为阳性反应,而无模板分子的小室为阴性反应,最后通过计数阳性反应室的个数,可绝对定量原始待测样品中的目标DNA分子拷贝数.实验结果表明,该数字PCR芯片可实现DNA单分子反应和核酸绝对定量,具有成本低、灵敏度高、节省时间和试剂以及操作简单等优点,为数字PCR方法在普通实验室的应用提供了一种新途径,可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、单细胞分析、产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究.

流动型微流控PCR扩增芯片的研究

组装了由注射泵进样系统、微流控芯片和三温区加热器组成的流动型 PCR扩增系统 ,该系统具有扩增速度快、交叉污染小、芯片可重复使用和操作方便等特点 .优化了芯片厚度、隔热材料和流速等影响 PCR扩增的因素 .在 4 .9min内经 2 4个循环成功地扩增了浓度为 1 ng/1 0 0μL的λ-DNA( 5 0 0 bp) .

微流控PCR芯片的研究进展

基因是人类的遗传密码,人类个体之间只有万分之一的基因不相同,却导致了人与人之间丰富的差异。了解这种差异对于科学研究具有巨大的应用价值。PCR是基因研究中常用的手段之一,但传统PCR仪存在反应时间长、能量消耗大、不便于集成与携带等缺陷,微流控技术与PCR结合可以有效缩小反应体系,提高反应效率,且易于集成化与微型化。本文按照微流控PCR芯片的结构分类,详细介绍了微池型、连续流动型PCR芯片,以及电泳、荧光、电化学和DNA杂交阵列等检测方法,并在最后进行了总结与展望。

微流控分析芯片上生化反应技术研究进展

综述了近几年来在微流控芯片上以检测或动力学研究为目的而进行的各种生物化学反应技术,包括酶反应、免疫反应、酶联免疫反应、PCR反应和含氮氧化物释放反应。对非均相反应的蛋白质在微管道中的固定技术、均相反应的管道设计技术以及在微流控芯片上集成生化反应的优越性等做了详细的讨论。

螺旋通道微流控PCR芯片连续自动扩增DNA片段的研究

研制了由内向外流动的螺旋通道微流控 PCR玻璃芯片 ,减少了 PCR反应液在微通道中流动时的分散和阻力 ;讨论了扩增循环数和进样速度对长片段基因扩增的影响 ,在 2 6min内成功扩增了质量浓度仅为1 0 ng/m L的 60 1 2 bpλ-DNA;通过将小孔径石英毛细管作为顺序注射 (SI)系统的连接管路 ,使其死体积降到 0 .3 0 μL.实现了微升级样品的自动换样、连续 PCR扩增和微通道洗涤等功能 .样品间无交叉污染 .每小时可扩增 5 0 0 bpλ-DNA试样 7个 .扩增产物片段大小和荧光强度的相对标准偏差分别为 0 .4%和 6.7% .

PMMA基PCR微流控生物芯片准分子激光加工

采用准分子激光在PMMA基片上刻蚀加工出PCR微流控生物芯片,分析了准分子激光能量密度和工作台移动速度对微通道加工质量(深度及粗糙度)的影响,加工过程中选择较低的激光能量密度和较高的工作台移动速度,都有利于获得底面更加光滑的微通道。通过热键合的方法制备出完整的密闭式PCR微流控生物芯片。

集在线荧光分析的连续流动反转录-聚合酶链式反应快速扩增检测食源致病性轮状病毒

采用含RNA反转录(Reverse transcription,RT)和在线荧光分析的连续流动聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction,PCR)微流控技术检测食源致病性轮状病毒。此RT-PCR微流控装置以加热铜块组成恒温带,以聚四氟乙烯毛细管微通道为反应体系构建而成。采用循环水冷却退火区,此装置能获得低至31℃的退火温度,而且温度控制及其稳定性良好,因而能满足不同PCR的要求。为了充分体现PCR微流控技术的优越性,在线荧光分析被用于检测PCR产物。当流速为7.5 mm/s时,轮状病毒RNA的cDNA扩增和在线荧光分析能在约12 min完成(扩增约10 min,在线分析约2 min)。在此集成化的RT-PCR微流控装置上,1 h可完成轮状病毒RNA的RT-PCR以及其扩增产物的在线荧光分析,样品检出限达到6.4×104 copies/μL。

基于嵌入式ARM的微流控PCR检测系统设计

为了实现微流控设备功能的集成化、提高交互系统的可操作性,提出一种基于嵌入式ARM的微流控聚合酶链式反应(PCR)控制系统及上位机软件的设计方案。系统硬件采用多个嵌入式ARM控制器与功能模块相互协调,制定可扩展的通信机制和协议,实现微流控PCR检测过程中的流路运动、温度控制、荧光信号采集等功能的集成控制。采用Qt结合SQLite数据库设计了上位机软件,利用多线程和节点映射,实现对硬件模块的协调控制以及检测信息存储。实验表明:该系统运行稳定,人机交互效果好,可操作性高,满足微流控PCR的集成功能需求。