基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

基于重组酶聚合酶扩增技术的牛源性成分快速检测方法

市场中肉类食品掺假的复杂多样化使得监管机构对动物源性成分鉴定的便捷性、准确性、灵敏性要求越来越高。尤其是市场上经济价值较高的牛肉类产品已成为制假的重灾区,迫切需要建立一种快速、高效的牛源性成分分子检测方法。基于此,以牛组成型表达基因β-actin为靶基因设计并筛选了几组牛特异性扩增的引物和探针组合,经过灵敏度检测和特异性验证,建立了一种牛源性成分实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)快速检测方法。通过优化试剂配比,提高了一步法提取牛肉制品DNA的效率,同时将PRA技术与胶体金免疫试纸条显色技术相结合实现了检测的便捷化和结果的可视化。实际应用结果表明,研究建立的牛源性RPA检测方法能够特异性地检测牛源性成分,且最低检测灵敏度可达到14.8个拷贝,通过胶体金免疫试纸条得到的可视化结果的准确性和灵敏度与实时荧光RPA相同。该方法特异性强、灵敏度高,整个过程在25 min内即可完成,极大缩短了检测时间。

重组酶聚合酶扩增技术在动物病原菌检测中的应用进展

体外核酸扩增技术在动物疫病病原检测中应用广泛。重组酶聚合酶扩增(RPA)作为一种新型的核酸等温扩增技术,可在较低温度(37~42℃)下扩增DNA或RNA,具有反应时间短、样品制备量少、特异性和敏感性高等优点。RPA突破了常规聚合酶链反应(PCR)实施时对实验室条件的依赖性,并能高效和灵敏地检测动物疫病病原。基于RPA技术的病原菌检测方法可实现对动物细菌病的现场快速诊断。论文综述了RPA技术的反应体系和条件、反应原理和产物检测方法等,介绍了RPA技术在动物病原菌检测中的应用和潜在价值,以期为动物疾病快速诊断研究提供参考。

重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。

DNA体外扩增技术——聚合酶链式反应(PCR)

PCR(PolymeraseChainReaction)译为聚合酶链式反应 ,是近年来发展起来的一种DNA体外扩增技术 .具有快速 ,简便和特异性强的优点 ,在分子生物学研究方面的应用具有广阔的前景 .本文简要介绍了PCR技术的原理 。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法,本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为102个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为101个/μL标准质粒,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。

荧光聚合酶链反应法用于新型冠状病毒核酸检测扩增产物污染治理的相关应用

目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)法用于新型冠状病毒(新冠病毒)核酸检测时扩增产物污染治理的相关应用。方法建立新冠病毒基因检测扩增产物污染模型、物面污染模型以及空间(气溶胶)污染模型,比较不同化学试剂及物理紫外线照射治理方式对物面污染和空间污染的清除效果。结果75%乙醇消毒剂组、核酸清除剂组和不同浓度有效氯制剂组的循环阈值(CT值)均明显高于对照组,其中核酸清除剂组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为34.74±2.63、34.68±3.25、35.71±3.07。500、1000、1500、2000、2500 mg/L有效氯制剂组对不同材质的CT值均高于75%乙醇消毒剂组,且有效氯的浓度越高,CT值越大,差异均有统计学意义。不同时长紫外线照射各组的CT值均明显高于对照组;其中以紫外线照射120 min组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为35.51±2.70、35.49±2.63、35.55±2.58,且紫外线照射时长越长,CT值越大,差异均有统计学意义。治理后的通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂组的CT值为36.98±3.47,明显高于治理前及其他各组,差异均有统计学意义。结论荧光PCR法用于新冠核酸检测时扩增产物污染的治理方式较多,对物面污染的治理方式可选择核酸清除剂及2500 mg/L有效氯制剂,以及紫外线照射120 min,对空间污染环境的治理方式可选择通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂联合应用,值得重视。

硅-玻璃聚合酶链式反应微芯片对β-葡糖苷酸酶基因的扩增

聚合酶链式反应 (PCR)微芯片是基于微机电系统 (MEMS)制作 ,在微芯片上进行PCR反应 ,实现生物样品扩增的一项新技术 .介绍了硅 玻璃PCR微芯片的设计和制作、微反应腔的清洗和表面处理、借助外置温度控制系统进行PCR扩增反应以及扩增产物在琼脂糖凝胶电泳下的检测分析 ,实现了对 β 葡糖苷酸酶 (GUS)基因的有效扩增 ,扩增时间由原来的 90min缩短到现在的 37min .

DNA片段体外扩增技术——聚合酶链式反应(PCR)的原理与应用

随着分子生物学的发展,对特定核甘酸片段进行分离。纯化及扩增已成为基因分子生物学研究的中心问题。过去,人们为了从生物材料中获得某一段特定的DNA(基因)顺序或者进行其顺序分析或鉴定。

三叶青相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系的建立与优化

目的建立浙江和江西产的三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)SRAP-PCR的反应体系和扩增程序。方法应用L9(34)正交设计方法,以三叶青基因组DNA为模板,研究了Mg2+、dNTP、引物和模板DNA 4种PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,根据梯度PCR仪引物的条带数量及清晰度选择退火温度。结果优化后的25μL反应体系包含:10×PCR buffer2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.15mmol/Ld NTP,0.15μmol/L引物,1.0U Taq DNA聚合酶,50ng DNA模板。扩增程序的最佳退火温度为51℃。并筛选出8对扩增产物丰富,多态性好的引物。结论正交设计优化的三叶青SRAP反应体系,经过10份样品检验,证明该体系稳定可靠,多态性好,可用于三叶青遗传多样性分析。

聚合酶链式反应微芯片系统用于微量生物样品的快速扩增检测

基于MEMS微加工技术设计和制作了一种集成微加热器和温度传感器的聚合酶链式反应(PCR)微芯片。PCR微芯片结构通过有限元模拟验证分析。该芯片在PCR扩增过程中具有良好的制热效率和热传递均匀性。在微型温度控制电路装置下进行热循环反应,芯片的温度起伏小于1℃/s,升降温速度分别达到5℃/s和3℃/s,30个热循环耗时30min。此系统已经用于GUS基因的扩增检测,获得了良好的结果,极大的缩短了热循环的时间,可用于微量生物样品的快速扩增检测。

用聚合酶链式反应扩增抗冻肽基因并在双元表达载体中克隆

抗冻肽基因导入植物的第一步合成了５＇－末端分别带有限制性酶ｘｂａＩ和ＫｐｎＩ识别位点的一对引物，以美洲拟鲽抗冻肽的ｃＤＮＡ克匪为模板，用锚定聚合酶链式反应扩增了抗冻肽基因，并克隆到细菌表达载体ｐＧＥＭ３２ｆ（—）和植物表达盒式载体ｐＧＡ６４３中，以限制性酶切分析和菌落杂交技术证明了转化子质粒ＤＮＡ中的含有抗冻肽基因，又用ＰＣＲ方法扩增了转化子的抗冻肽基因，从而证实了克隆成功．

聚合酶链反应(PCR)对未知序列DNA的扩增技术

<正> 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是由引物介导,在体外将特异性DNA序列利用酶促作用进行扩增的方法。双链DNA热变性,然后在低温下与引物退火,再在中等温度下进行延伸,三步为一循环。一般经30～35次循环,很容易将目的基因或DNA片段特异地扩增至少10~6～10~7倍。它已是分子生物学研究中常用的、不可缺少的一项基本技术。但常规PCR需在待扩增的已知序列两端分别设计两个寡核苷酸引物。

聚合酶链反应(PCR)技术与基因扩增分析仪器(PCR仪)

较为全面地论述了聚合酶链反应(PCR)技术与基因扩增分析仪器(PCR仪)。较为详细地阐述了PCR基本原理、PCR结果的检测与分析、实时定量PCR技术、影响PCR效果的因素、PCR技术的应用、PCR仪器的现状及其发展方向。

正交设计优化半夏相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系

目的采用正交设计优化半夏SRAP-PCR的反应体系。方法以半夏基因组DNA为模板,应用L_(16)(4~5)正交表,研究了Taq酶、Mg^(2+)、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种SRAP反应组分浓度变化对扩增结果的影响。结果优化反应体系为:25μL反应体系中含有buffer2.5μL、Taq酶1.0U、Mg^(2+)2.5mmol/L、引物0.8μmol/L、dNTPs0.1 mmol/L、模板DNA 50 ng。结论正交设计能客观高效的优化半夏SRAP反应体系。

提高SAF基因启动子区DNA模板聚合酶链式反应的扩增效率

背景:血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区鸟嘌呤和胞嘧啶的含量偏高,常规聚合酶链式反应扩增不易成功。目的:探索提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区富含鸟嘌呤和胞嘧啶的DNA模板聚合酶链式反应扩增方案及优化的扩增体系。方法:提取THP-1细胞基因组DNA作为模板,通过97℃高温预变性及最佳退火温度的探索优化聚合酶链式反应的反应条件,在聚合酶链式反应扩增体系中添加不同浓度的增强剂二甲基亚砜改善反应体系。建立提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因富含鸟嘌呤和胞嘧啶的启动子区聚合酶链式反应扩增效率的方法,同时评估不同浓度二甲基亚砜对聚合酶链式反应扩增结果的影响。结果与结论:97℃高温预变性使模板DNA充分解链,同时提高退火温度至60℃,有利于提高聚合酶链式反应扩增产率;反应体系中添加2%二甲基亚砜可以提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区聚合酶链式反应产物的特异性和产率,但是鸟嘌呤和胞嘧啶含量不同对增强剂的依赖不一样。结果证实,高温预变性和较高的退火温度可以保证充分解链的模板DNA与引物特异性结合,但是DNA模板鸟嘌呤和胞嘧啶含量的不同对增强剂二甲基亚砜的依赖有差异。

山羊支原体山羊肺炎亚种重组酶聚合酶扩增技术的建立

为检测山羊传染性胸膜肺炎,选择Mccp-arcA假基因作为靶基因,用Primer 3 plus设计筛选生物素标记的特异引物和荧光素标记的探针,将双标记扩增产物结合到核酸检测试纸条,通过优化反应温度和时间,建立了一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的重组酶聚合酶扩增技术,对其灵敏度、重复性、准确性和特异性进行了试验,并初步用于临床样品的检测。结果显示,山羊传染性胸膜肺炎核酸阳性样品能够在核酸检测试纸条上显示阳性条带,阴性样品无条带。试验具有良好的重复性和敏感性(达到10 copies/μL)。用建立的重组酶聚合酶扩增技术与普通PCR方法同时检测疑似山羊传染性胸膜肺炎8份样品,结果均为3份阳性和5份阴性,符合率100%。该检测方法适用于山羊传染性胸膜肺炎的快速诊断,为Mccp的快速检测提供了新的技术。

重组酶聚合酶扩增技术用于脑脊液中肺炎链球菌检测的价值

目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)技术用于脑脊液(CSF)中肺炎链球菌检测的价值。方法利用RPA技术检测CSF中肺炎链球菌。根据肺炎链球菌LepA基因设计RPA反应引物,收集临床确诊和疑似的52例细菌性脑膜炎患者为研究对象,采集CSF标本并提取DNA,采用RPA技术对临床CSF进行LepA基因扩增检测。结果52例患者的CSF标本经微生物培养有19例(36.5%)为阳性,阳性标本中有7例检出肺炎链球菌,这7例患者CSF标本的RPA检测结果均为阳性。微生物培养为阴性的33例(63.5%)患者中有7例患者CSF标本的RPA检测结果为阳性。共14例患者CSF标本的RPA检测结果为阳性,从中选取10例患者CSF标本的RPA扩增产物经纯化后,与肺炎链球菌LepA基因目的片段进行核酸序列比对,其比对结果一致。结论RPA技术可用于肺炎链球菌性脑膜炎病原菌的快速检测。