序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)结合血清学在疑难血型鉴定中的应用

目的 探讨血型血清学与序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)基因分型在ABO疑难血型鉴定中的作用。方法 用血清学分析鉴定的ABO疑难血型标本80例,同时采用PCR-SSP法进行基因分型,结合两种方法学结果,确定血型及制定输血策略。结果 血清学鉴定亚型40例,其他原因引起的抗原抗体缺失或减弱正常血型40例;PCR-SSP法基因分型亚型41例(3例二者结果不一致:血清学Ael型1例,基因分型O2O2;血清学O型1例,基因分型BO1;血清学A型1例,基因分型AB),正常血型39例。结论 使用血清学结合基因分型鉴定ABO疑难血型具有重要意义。

猪萨佩罗病毒聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)是引发猪腹泻的重要病毒之一。为开发一种能快速、准确检测PSV的聚合酶链式反应检测方法,针对PSV的保守区3D基因设计了一对特异性引物,优化了聚合酶链式反应退火温度,分析聚合酶链式反应检测方法特异性和灵敏度,并应用于猪场样品检测。结果表明:建立的聚合酶链式反应检测方法可特异性扩增出PSV目的片段,对其他非靶标猪腹泻病毒则无条带产生,检测低限为5拷贝/μL;在浙江地区采集的88个健康猪粪便样本中检测PSV阳性率为7.95%。该PSV聚合酶链式反应检测方法特异性强、灵敏度高,可应用于PSV前期诊断和防控。

聚合酶链式反应-特异性序列引物基因定型在新生儿溶血病ABO血型定型中的应用

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(PCR-SSP)基因定型在新生儿溶血病(CHDN)ABO血型定型中的应用。方法收集20例来自广东省肇庆市第一人民医院新生儿溶血病(HDN)的样本,对这些样本进行ABO血型鉴定等一系列血型血清学方法进行检测,然后用PCR-SSP基因定型技术进行样本的基因分型。结果与其血型的血清学分型结果进行比较,新生儿溶血病ABO血型的定型是新生儿输血的必要保障,而PCR-SSP基因分型较血型血清学方法更快捷、准确。结论 PCR-SSP基因正型技术将不再局限于疑难血型的鉴定中,并会越来越多地应用于HDN的鉴定中。

聚合酶链反应-序列特异性引物方法检测儿科疾病基因多态性

目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,以推广其在儿科疾病分子水平研究中的应用。方法应用PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性,TNF-α-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的多态性进行分析,基因型清晰,且基因分型快速、准确。结论PCR-SSP适合对大样本、多基因的多态性进行分析,成本低、快速、准确,在儿科疾病分子水平研究中前景良好。

蜡样芽孢杆菌特异性基因筛选及聚合酶链式反应检测方法的建立

该研究以蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的基因组为模板,利用比较基因组学方法筛选并通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证获得3个蜡样芽孢杆菌的特异性基因,用于食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测,并对引物的特异性、灵敏度、抗干扰能力和人工污染检测限等进行评价。结果表明,筛选获得的3个基因片段特异性较好。其中以gene2626设计的引物gFA2特异性最好,检测灵敏度可达359. 5 fg/μL。抗干扰评价结果表明在牛肉背景菌群浓度5. 28×10^7CFU/m L和猪肉背景菌群浓度7. 75×10^6CFU/m L的干扰下,蜡样芽孢杆菌的最低检出限为3. 74×10^3CFU/m L。人工污染试验结果表明,蜡样芽孢杆菌经增菌培养10 h后,人工污染的牛肉和猪肉样品中蜡样芽孢杆菌的检出限分别为4. 62和8. 38 CFU/g。因此该研究筛选的特异性基因及建立的PCR检测方法在食品中蜡样芽孢杆菌的快速检测方面具有一定的应用潜力。

序列特异性引物多聚酶链反应方法进行大样本多基因的多态性鉴定(英文)

目的建立多个基因同时进行多态性分析的序列特异性引物多聚酶链反应(PCR-SSP)方法,以满足其在临床检验中进行基因多态性鉴定时的应用。方法应用优化后的PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性:TNF-α-308A/G和-238G/A变异、IL-6-174G/C变异、CYP2D6*10B外显子第188位的C/T变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的基因多态性同时进行分析,基因型清晰,而且基因分型快速、准确。结论优化后的PCR-SSP适合对大样本、多个基因的单核苷酸位点变异进行多态性分析,值得在临床检验的应用中推广。

纳米银颗粒增强聚合酶链式反应长片段DNA反复扩增的特异性

基因操作者经常需要把数量稀少的DNA样品进行反复扩增以供进一步研究之用.在反复扩增过程中,上一次扩增产物当作下一次扩增的模板使用.对于较短的DNA片段(几百个碱基),一般反复扩增不会遇到特别的困难;但是较长DNA片段(几千到几万个碱基)的反复扩增一般会极大地降低聚合酶链式反应(PCR)的特异性.实验中发现,当扩增较长片段基因时,在常规PCR热循环体系中添加粒径平均为70 nm的银颗粒,使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL,可以在一定程度上保持PCR反复扩增反应的特异性.其机理之一可能是常规PCR反应体系在添加了纳米银颗粒后改善了溶液的导热性能.

氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增效率、灵敏度和特异性的影响

以人类基因组DNA和志贺氏菌粗制裂解菌液为模板,扩增115 bp的Alu基因片段和402 bp的ipaH基因片段.通过设置氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)和模板的浓度为变量,分别研究了氧化石墨烯对聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增效率和灵敏度的影响;运用多轮PCR扩增方法研究了氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增特异性的影响.结果显示,氧化石墨烯有效提高PCR扩增效率的范围为9—14倍,提高PCR灵敏度一个数量级以及增加多轮PCR扩增中的两轮扩增反应.从原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)的结果可以看出,本文制备的氧化石墨烯片层厚度主要集中在0.5—0.8 nm,少数大于1 nm,总体具有较大的比表面积.除此之外,本文还发现当氧化石墨烯浓度到达μg·μL^(-1)后,引物二聚体与氧化石墨烯的浓度呈正比,说明氧化石墨烯优化PCR的主要影响因素是其与引物的相互作用.

金纳米粒子对聚合酶链式反应体系中长链DNA特异性扩增的效应

以乙烯受体基因ETR1（2500bp）和山梨醇脱氢酶基因（SDH）（1100bp）为材料，研究了不同浓度金纳米粒子对聚合酶链式反应（PCR）体系中大于1000bp的长链DNA特异性扩增的效应。结果表明，金纳米粒子显著增强了ETR1和SDH在PCR时的特异性扩增，有效降低了非特异性扩增。在ETR1和SDH的PCR中，金纳米粒子适宜浓度为0．4nmol·L^-1。在50℃-62℃的退火温度范围内，金纳米粒子均能够显著增强ETR1和SDH的特异性扩增。因此，金纳米粒子不仅提高了1000bp以上的长链DNA在PCR扩增的特异性，而且拓宽了PCR的退火温度范围。

建立序列特异性引物PCR检测儿茶酚胺氧位转移酶与单胺氧化酶基因多态性的方法

目的建立用PCR-SSP检测儿茶酚胺氧位转移酶(COMT)与单胺氧化酶(MAOA)的基因多态性的方法。方法根据COMT与MAOA的基因序列,采用针对变异位点的点突变方式设计出顺序特异性引物(SSP)进行PCR扩增,并借助常规电泳确定基因型。结果用PCR-SSP来研究COMT与MAOA基因多态性的方法特异性强,重复性好,而且简便、经济、快速。结论PCR-SSP可对具有单核苷酸突变的基因分型,应用前景良好。

丙型肝炎病毒型特异性聚合酶链反应基因分型的临床应用

目的 探索丙型肝炎病毒 (HCV)基因型在不同人群中的分布规律及流行优势型。方法 分别对健康体检者、住院患者和血液透析患者抗HCVIgG阳性标本 ,用自行设计的 5’非编码区 (5’ NCR) 1、2、3、1b型特异性引物进行扩增和基因分型。结果 3组人群中血液透析患者HCV感染率最高 ,抗HCVIgG和HCVRNA阳性率分别为 5 5 .37%和 38.84%。基因型以 1b亚型为主 ,1b及 1b的相关型占 91.6 7%。结论 本地区HCV流行优势型为 1b亚型。

新西兰柔鱼与北太平洋柔鱼的品种特异性聚合酶链式反应鉴定

利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增新西兰柔鱼和北太平洋柔鱼的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因,通过多重序列比对检测2种鱿鱼之间的多态性位点。根据2种鱿鱼的特异性位点分别设计2种鱿鱼的品种特异性引物,并利用多重PCR实现2种鱿鱼品种的特异性鉴定和区分。结果表明:建立的品种特异性PCR鉴别体系对新西兰柔鱼和北太平洋柔鱼分别扩增出214 bp和339 bp的品种特异性条带,该方法的检测限低至0.1 ng,且能检测出新西兰柔鱼中1%的北太平洋柔鱼掺入,并能有效检测市场上2种鱿鱼及其复配鱼糜制品的原料来源。

逆转录聚合酶链反应检测Ⅲ型登革病毒的敏感性和特异性研究

本文应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测Ⅲ型登革病毒基因。所设计引物在E基因组,引物2位于核苷酸序列的1139～1158位,引物1位于1453～1471位,反应产物为333bp,内含1个HindⅢ限制性内切酶位点,酶切后有128 bp和199 bp两个片段。产物在含溴化乙锭的2％琼脂糖中电泳。采用RT-PCR法可测出少至5个半数组织细胞培养感染量(TCID_so)的病毒RNA。

聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB_1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。

聚合酶链式反应(PCR)引物自动设计及分析系统的研制

这是一套在IBM—PC兼容性微机上开发的分子生物学特别是基因体外扩增(PCR)实验辅助设计系统,为当前分子生物技术发展提供有用的支撑技术。本软件系统由2个部分组成,其一是基础软件包括核酸和蛋白质序列数据库及序列分析软件,其二是特异的PCR引物设计程序即PCRDESN(引物质量评价)

检测HBV基因组nt551A→G突变特异性聚合酶链反应的建立与初步验证

目的：建立一种特异而敏感的检测乙型肝炎病毒(HBV)基因组nt551位A→G变异株的方法。方法：根据已知的HBV基因组序列，结合国内主要流行亚型adr和adw的特点，合成在nt55l位分别为A或G两对引物，建立了突变特异性聚合酶链反应方法。结果：利用该方法对由16份乙型肝炎患者血清扩增的HBVS基因片段进行了初步检测。结果14份样本nt55l为A，l份为G，l份nt55l非A非G。经核苷酸序列分析表明结果正确。结论：该法是鉴定HBV基因组nt55l位A→G变异株的特异而敏感的方法。

两种聚合酶在等位基因特异性引物延伸法检测SNP中的应用比较

目的比较TaqTMHotStarDNA聚合酶和TspTMPlatinum DNA聚合酶在等位基因特异性引物延伸法检测SNP中的应用效果。方法取120例抗血栓治疗患者全血进行DNA提取、多重PCR扩增,将产物分2份,1份用TaqTMHotStarDNA聚合酶进行等位基因特异性引物延伸,1份用TspTMPlatinum DNA聚合酶进行等位基因特异性引物延伸,然后进行杂交反应,用Luminex 200系统检测CYP2C19基因多态性,同时将所有样本送第三方进行基因测序。结果TaqTMHotStarDNA聚合酶组检测结果与测序结果完全一致,TspTMPlatinum DNA聚合酶则会出现一些偏差,说明TaqTMHotStarDNA聚合酶参与的检测结果分辨率明显高于TspTMPlatinum DNA聚合酶参与的检测结果。结论两种聚合酶在等位基因特异性引物延伸法检测SNP中均可以取得一定的检测结果,但是为了结果的可靠性建议在检测过程中使用TaqTMHotStarDNA聚合酶。

聚合酶链式反应检测猪细小病毒方法的研究

本研究依据编码猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,合成了一对寡核苷酸引物,通过减少病毒核酸的提取时间、费用及优化聚合酶链式反应(PCR)的条件,成功地从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中扩增出预期的158bp片段,经EcoRⅠ酶切鉴定,证实了该扩增片段的特异性。经敏感性试验测定,PCR的最低检出量为0 008病毒血凝(HA)单位。这些结果表明本试验建立的PCR对PPV的检测人有快速、简便、经济、灵敏度高和特异性强的特点。

基于性状鉴别和特异性PCR技术对膨腹海马的鉴别研究

目的:采用性状鉴别和聚合酶链式反应(PCR)技术对我国主要的海马养殖品膨腹海马Hippocampus abdominalis Leeson进行研究,为该品种鉴别技术开发提供数据支持。方法:通过查阅文献资料并结合样品统计观察,总结膨腹海马的性状鉴别特征;根据膨腹海马及其他海马的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,筛选出膨腹海马的特异性单核苷酸多态性(SNP)位点,设计专属膨腹海马的引物PFHM-Primer-F和PFHM-Primer-R。通过优化PCR体系反应条件,考察最佳的PCR反应体系。结果:膨腹海马的核心性状特征主要包括有较多的体环、尾环和背鳍条数,背鳍覆盖4个体环+1个尾环;眼周和鳃盖部具有明显的大而黑的斑点等。基于COⅠ序列展开的PCR鉴别方法研究表明,当退火温度为65℃,循环30次时,膨腹海马样品在100~250 bp呈现单一明亮条带,而其他品种均无此条带。结论:建立的性状鉴别和特异性PCR鉴别方法可快速鉴别膨腹海马,为我国海马新资源的鉴别和后续开发提供参考。