应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳和16S rDNA技术分析果冻胀气原因

目的分析某品牌果冻胀气的原因。方法提取胀气果冻总DNA,采用聚合酶链式反应-变性度凝胶电泳技术(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)进行菌群结构分析,同时采用平板分离法从果冻中分离细菌。并将分离得到的菌株进行16S rDNA扩增和测序比对分析。将分离的菌株接种到正常果冻中进行产气实验。结果 PCR-DGGE和平板分离结果表明,在胀气果冻中分别只检测到一种细菌,未检测出真菌。测序比对结果表明该细菌属于芽孢乳杆菌属。将该菌接种到正常果冻中会引起果冻胀气。结论芽孢乳杆菌是导致该品牌果冻胀气的主要因素。

聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳技术研究梯田式人工湿地微生物群落动态变化

采用聚合酶链反应(PCR)—变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对梯田式人工湿地(TTCW)和复合垂直流式人工湿地(IVCW)生活污水处理系统内的微生物群落结构的动态变化及其对生活污水处理效果的影响进行了对比研究。结果表明:(1)TTCW和IVCW对生活污水均具有较好处理效果,其COD去除率平均分别为76.2%和72.6%、TP去除率平均分别为90.7%和85.6%、NH4+-N去除率平均分别为65.2%和58.8%;TTCW增氧作用明显。(2)2种人工湿地内均存在丰富的微生物群落,并均存在共有的微生物种群;在湿地沿程不同位置均存在一定数量的优势种群。(3)TTCW强化了大气复氧能力,使得湿地内DO较相同深度的IVCW的高。TTCW具有较强的污染物去除能力,特别是具有高效的脱氮除磷能力。这种能力可能主要是TTCW中微生物群落结构的变化所致。

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳在环境微生物中的应用

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境微生物学中微生物群落多样性、动态性分析和功能细菌的跟踪。阐述了PCR-DGGE的原理与方法,分析了其在环境微生物学中的应用,并对其应用前景进行了展望。

聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析在毒死蜱胁迫下土壤真菌群落结构演替

为评价毒死蜱施用后对土壤真菌群落结构的影响,将农田土壤用终质量分数5mg/kg毒死蜱处理,同时以不施用毒死蜱为对照,定期采集土样进行毒死蜱残留测定并提取土壤DNA,采用基于染色体内转录间隔区(internaltranscribed spacers,ITS)ITS1f-GC/ITS2和28SrDNA U1-GC/U2引物对进行聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳,获得的指纹图谱利用Quantity One软件进行数字化分析,计算样品的多样性指数(H),并用Matlab软件进行主成分分析.ITS1f-GC/ITS2和U1-GC/U2扩增区域分析结果表明,毒死蜱施用后第7～60天内土壤真菌群落结构与对照相比发生很大改变,且毒死蜱处理样品真菌群落结构保持基本稳定,多样性指数明显提高;主成分分析显示,毒死蜱处理样品与对照明显分在2个不同的区域,充分表明毒死蜱对土壤真菌群落结构影响迅速且持久.

聚合酶链式反应变性及退火温度与产物假阴性之间的关系

目的探讨聚合酶链式反应(PCR)变性及退火温度与产物假阴性之间的关系。方法以含有HBV完整基因组的重组质粒pUC-19为模板进行PCR扩增,人为改变PCR循环的变性或退火温度,探讨其与产物假阴性之间的关系。结果随着变性温度的降低和退火温度的升高,PCR扩增效率降低,产物量明显减少。当变性温度降低至85℃及85℃以下,退火温度升高至72℃时,琼脂糖凝胶电泳肉眼观察不到扩增产物。结论过低的变性温度和过高的退火温度会导致PCR产物出现假阴性。

变性梯度凝胶电泳在环境微生物研究中的应用详解

结合笔者等多年积累的经验详细介绍环境微生物学研究中变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术应用全步骤:从环境样品中直接提取总DNA,利用5′端含GC夹子的引物PCR 16S rDNA的部分片段,将PCR产物在含有浓度线形递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析,使不同来源的DNA片段在电泳胶中分离,从胶中切出分离的DNA片段测定碱基序列,进行分类分析。PCR-DGGE技术能够检测不可培养的微生物基因,而DGGE技术与克隆等其他技术结合更能发挥其分离作用。

变性梯度凝胶电泳中PCR实验条件的探讨

变性梯度凝胶电泳（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）能可靠快速地检测含有一个碱基突变、达５３６ｂｐ的ＤＮＡ片段。当结合ＰＣＲ技术后，在一个引物的５′端加入３０～５０ｂｐ的ＧＣ片段（ＧＣ－ｃｌａｍｐ），...

常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析

为了解我国典型有毒有害赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱以及DGGE技术在赤潮藻类分析鉴定中的作用,本课题组运用DGGE技术,研究了我国沿海7种重要赤潮藻类的单一种类以及混合种类样品的18S rDNA V3区的DGGE指纹图谱,并且对2009年10月底在广东省珠海海域发生的双胞旋沟藻(Cochlodini-um geminatum)赤潮样品进行了DGGE分析.结果表明,DGGE技术能够对环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻、中肋骨条藻、塔玛亚历山大藻、双胞旋沟藻7种常见的海洋赤潮藻类具有较好的区分效果,同时监测出赤潮样品中双胞旋沟藻、血红哈卡藻、环节环沟藻和海洋原甲藻4种优势种,种类组成与显微镜观察结果具有较好的一致性.结果说明DGGE技术可作为一种辅助方法对赤潮藻类进行分类鉴定.

冷却牦牛肉贮藏过程中优势菌的PCR-变性梯度凝胶电泳分析

应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究托盘保鲜膜包装的冷却牦牛肉在4℃贮藏过程中的微生物多样性及其动态变化。直接从样品中提取细菌总的DNA,采用降落PCR扩增16S rDNA的V3可变区序列,再通过DGGE得到动态变化的指纹图谱,并对主要条带进行测序分析。结果表明:检测到的优势腐败菌为Pseudomonas sp.(假单胞菌)、Lactococcus sp.(乳球菌)、Acinetobacter sp.(不动杆菌)、Brochothrix thermosphacta(热死环丝菌)、Enterobacteriaceae bacterium(肠杆菌科细菌),此外还检测到Uncultured Citrobacter sp.(非培养的柠檬酸杆菌)和Staphylococcus sp.(葡萄球菌)。

变性梯度凝胶电泳装置及其在DNA突变检测中的初步应用

设计了一套适用于变性梯度凝胶电泳 (DGGE)的装置。该装置为带缓冲液循环系统、可精确控制温度的夹芯式双垂直电泳槽 ,其整个凝胶板内的控温精度和均匀度均在± 0 .5℃范围内。对其在DNA突变检测中的应用作了初步的探讨。通过PCR DGGE连用成功地分离了野生型p5 3基因和含点突变的p5 3基因 (第 141密码子由TGC突变为TAC)。

用变性梯度凝胶电泳分析PCR克隆的突变率

用变性梯度凝胶电泳技术比较分析了分别由TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶催化扩增的产物克隆入pUCm T DH5α系统中产生的重组子。发现包含突变的重组子分别为 2 1.5 0 %和 3.5 0 % ,前者为后者的 6 .15倍。转化为每 10 0nt净扩增长度的突变率分别为 7.44 .%和 1.2 1%。

提高SAF基因启动子区DNA模板聚合酶链式反应的扩增效率

背景:血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区鸟嘌呤和胞嘧啶的含量偏高,常规聚合酶链式反应扩增不易成功。目的:探索提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区富含鸟嘌呤和胞嘧啶的DNA模板聚合酶链式反应扩增方案及优化的扩增体系。方法:提取THP-1细胞基因组DNA作为模板,通过97℃高温预变性及最佳退火温度的探索优化聚合酶链式反应的反应条件,在聚合酶链式反应扩增体系中添加不同浓度的增强剂二甲基亚砜改善反应体系。建立提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因富含鸟嘌呤和胞嘧啶的启动子区聚合酶链式反应扩增效率的方法,同时评估不同浓度二甲基亚砜对聚合酶链式反应扩增结果的影响。结果与结论:97℃高温预变性使模板DNA充分解链,同时提高退火温度至60℃,有利于提高聚合酶链式反应扩增产率;反应体系中添加2%二甲基亚砜可以提高血清淀粉样蛋白A转录激活因子基因启动子区聚合酶链式反应产物的特异性和产率,但是鸟嘌呤和胞嘧啶含量不同对增强剂的依赖不一样。结果证实,高温预变性和较高的退火温度可以保证充分解链的模板DNA与引物特异性结合,但是DNA模板鸟嘌呤和胞嘧啶含量的不同对增强剂二甲基亚砜的依赖有差异。

关于蕲蛇聚合酶链式反应法鉴别结果判断标准的商榷

蕲蛇为蝰科动物五步蛇Agkistrodon acutus（Guenther）的干燥体，具有祛风、通络、止痉等功效，临床用于风湿顽痹、麻木拘挛、中风口眼喁斜，半身不遂、抽搐痉挛等，历版《中国药典》均有收载，《中国药典}2010年版一部首次采用聚合酶链式反应法（PCR）对其进行鉴别，规定“供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，

嗜酸性细菌浸出废旧线路板过程中微生物群落的聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳分析

以富集的嗜酸性细菌为接种物，进行废旧线路板的生物浸出实验，同时收集浸出不同时间的微生物样品，利用聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳技术分析了浸出过程中微生物群落结构的变化．结果表明，嗜酸性细菌能在48h内浸出废旧线路板中96．36％的铜．从变性梯度凝胶上挑选的明亮条带分析结果显示，Z1-Z7七个条带序列与氧化亚铁硫杆菌叫cidithiobacillusferrooxidans）的序列同源性均在99％以上，即均为Acidithiobacillusferrooxidans．浸出0，5，24和60h的样品中ZI~Z7的组成比例变化不大，其中Z3相对丰度一直最高，分别为72．70％．82．90％，79．00％和85．80％．浸出过程中微生物群落结构演变较平缓，始终为Acidithiobacillusferrooxidans菌群，菌株Z3是整个浸出过程中的优势菌种．

非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法临床应用探讨

目的:建立一种省时简便和灵敏可靠的检测筛查基因点突变的方法,即PCR-SSCP(PCR-Singlestrandconformationpolymorphism)银染分析技术。方法:应用改进的PCR-SSCP银染分析技术,检测妊娠期胆内胆汁淤积症患者外周血基因组DNA中MDR3基因外显子14的点突变情况。结果:非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳在有冷水循环装置控制下,结果稳定可靠,受环境温度影响小;但银染时,需根据室温调整染色时间及显影液的配制,当室温高于25℃时,碳酸钠需预冷,有利于控制背景色,得到更为满意的结果。结论:利用非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染法筛查目的基因的点突情况,具有省时简便和灵敏可靠的特点,且重复性好,避免了盲目测序及资金浪费。

用凝胶电泳研究发夹型引物检测端粒酶活性

端粒酶是目前最广谱的恶性肿瘤的预警标志物 ,其活性对大多数恶性肿瘤的诊断均具有较高的敏感性和特异性。本文针对端粒酶延伸产物序列的特殊性 ,开发一类新型发夹型引物。该引物具有的发夹结构使得PCR扩增只能在加热条件下启动。运用这项技术 ,建立用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性的新方法。减少非特异性扩增产物及引物二聚体的生成 ,提高检测的专一性。将该法用于恶性肿瘤细胞提取物中端粒酶活性的检测 ,取得满意的结果。

影响聚式酶链式反应实验效果的基本因素

研究聚式酶链式反应(PCR)实验中影响其扩增效果的多种因素,寻求反应体系中理想的各因素浓度配比。选取含5+10优质亚基的小麦品种为材料,以特异扩增1DX5基因PCR实验为例,从模板DNA、引物终浓度、Taq酶、二价镁离子、4dNTPs混合液、缓冲液浓度几方面入手,通过设计梯度实验,研究不同因素对PCR扩增效果的影响。结果表明,反应体系6个基本因素,缺少任何1个都扩增不出产物。在反应总体积25μL的PCR反应体系中,模板DNA选用32 ng/μL,Mg2+终浓度2 mmol/L,Taq酶1.2 U/25μL,引物0.8μmol/μL,4dNTPs0.3 mmol/L,缓冲液1×buffer最为合适,能扩增出理想的结果。

化学生物学实验“DNA片段扩增和琼脂糖凝胶电泳检测”的改进研究

DNA片段扩增和琼脂糖凝胶电泳检测是化学生物学的一个重要专业综合实验,旨在培养学生的综合实验技能并拓展科学思维。通常情况下,该实验利用聚合酶链式反应(PCR)进行DNA片段的扩增,但PCR仪器和试剂较为昂贵,大幅增加了实验成本。此外,PCR操作的技术性较强,操作繁琐并涉及到多种微量试剂的移取,实验误差较大导致难以得到令人满意的实验结果。针对上述问题,该文提出利用杂交链式反应(HCR)代替PCR法进行DNA片段的扩增,该方法为无酶等温核酸扩增技术,简单、温和且不需要昂贵的设备。此外,通过指导学生进行DNA序列的设计,可以加深对HCR原理、碱基互补配对原则的理解和应用。基于HCR的DNA片段扩增避免了昂贵仪器和试剂的使用,降低了实验成本,简化了实验操作,提高了实验的成功率。