苏姜猪Lrh-1基因PCR-SSCP多态性及其与产仔数的关系

为深入研究苏姜猪肝受体类似物质-1(Lrh-1)基因的多态性及其与产仔数性状间相关性,依据NCBI数据库中猪Lrh-1基因核酸序列设计2对引物,采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对苏姜猪Lrh-1基因进行多态性检测。检测结果显示,引物P1 PCR扩增产物存在7种SSCP条带型,共有4个碱基突变位点,分别为27287662、27287593、27287535和27287511位;引物P2 PCR扩增产物存在2种SSCP条带型,碱基突变位于27423038位;将扩增序列与猪Lrh-1CDS区进行比对分析,其中27287662、27287593和27423038位的碱基突变位于配体结合域(LBD)区内,且突变均属同义突变,表明LBD区对于Lrh-1基因功能稳定具有重要作用;不同碱基突变位点的基因频率经群体遗传学分析,除27287511位点处于群体不平衡状态(P<0.05)外,其他位点均达群体平衡状态(P>0.05);Lrh-1基因P1和P2扩增区SSCP不同类型苏姜猪第1胎和第2胎平均产仔数间无显著差异(P>0.05)。

利用PCR-SSCP技术检测中国汉族人PKD2基因的突变

目的：检测中国汉族人Ⅱ型多囊肾病基因PKD2的突变。方法：筛选临床确诊的26个中国汉族家系中31例常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）患者，提取外周血白细胞DNA，应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR－SSCP），取异常条带标本进行核苷酸序列测定，判别PKD2外显子突变位置及类型。结果：以20例健康志愿者为对照，从31例患者中成功检测出2种突变。1种为无义突变，系PKD2外显子13的第2407位碱基由胞嚼陡置换为胸腺嘧啶，形成1个终止密码子；另1种为错义突变，系PKD2外显子4的第964位碱基由胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，使编码氨基酸由精氨酸变为色氨酸。结论：本研究建立了PCR－SSCP直接检测我国汉族人PKD2突变方法，检测出2种基因突变，为今后开展ADPKD患者囊肿前诊断提供了实验基础。

孕酮受体基因多态性及其与小尾寒羊产羔数的关系

设计15对引物,采用PCR-SSCP技术检测孕酮受体(progesterone receptor,PGR)基因全部9个外显子在小尾寒羊、湖羊、特克塞尔和多赛特中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊产羔数的影响。只有引物P9扩增片段具有多态性。对于P9扩增片段,在小尾寒羊、湖羊和多赛特中均检测到AA、AG和GG型,在特克塞尔中只检测到AA和AG型。测序表明GG型与AA型相比在217 bp处有一单碱基突变(A→G),但未引起氨基酸变化。GG型和AG型小尾寒羊产羔数均值分别比AA型的多0.97只(P<0.05)和0.64只(P<0.05),GG型和AG型小尾寒羊产羔数差异不显著(P>0.05)。结果初步表明PGR基因的G等位基因是提高绵羊产羔数的一个潜在有效的DNA标记。

绵羊TLR4基因的遗传多态性分析

为了研究永昌羊、小尾寒羊、白萨福克羊和特克塞尔羊4个品种的舍饲绵羊TLR4基因的遗传多态性及变异特征,采用PCR-SSCP方法,检测这4种绵羊(共404只)TLR4基因第3外显子部分基因片段的多态性以及产生变异的各等位基因序列。结果显示,4种绵羊中共发现6种等位基因控制的7种基因型,永昌羊、白萨福克羊和特克塞尔羊均未检测到E和F等位基因,小尾寒羊未检测到D等位基因;与GenBank中羊TLR4基因序列比对发现,扩增片段中有19个核苷酸多态位点,编码的氨基酸序列中有9个氨基酸多态位点;经χ2适应性检验,4个绵羊品种均位于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),其中白萨福克羊、特克塞尔羊和小尾寒羊处于高度多态(PIC>0.50),而永昌羊处于中度多态(0.25<PIC<0.50)。

PCR-SSCP在恶性血液病N-ras癌基因点突变检测中的应用

目的：检测血液系统肿瘤中Ｎ－ｒａｓ癌基因点突变的活性。方法：采用ＰＣＲＳＳＣＰ技术分析了２８例恶性血液病Ｎｒａｓ基因的突变活性，包括：ＡＮＬＬ６例，ＡＬＬ１２例，ＨＤ２例，ＮＨＬ３例，ＭＤＳ５例。结果：２８例中ＰＣＲＳＳＣＰ检测与正常对照，发生阳性者４例（１４．６％），其中ＡＬＬ１例（８．３％）、ＡＮＬＬ１例（１６．６％）、ＭＤＳ２例（４０％）。４例中有２例临床缓解后持续阳性，１例为ＡＬＬ患者，于骨髓移植后１０４ｄ复发死亡。１例ＭＤＳ患者转化为急性白血病，另２例临床缓解后３个月检测转阴，其中１例为ＡＮＬＬ，１例为ＭＤＳ。结论：ＰＣＲＳＳＣＰ方法可作为一种癌基因点突变检测手段常规应用于临床，但值得注意的是，ＰＣＲＳＳＣＰ方法只能提供分析区域是否存在突变点。

32例肿瘤组织中p53基因突变的PCR-SSCP、银染色检测

目的 检测肿瘤组织中 p5 3基因的突变率 ,探索其在肿瘤发展过程中的作用 .建立PCR SSCP检测 p5 3突变的常规方法 .方法 检测 32例癌组织和癌旁组织 .用盐沉淀制备样品DNA ,以p5 3基因exon7设计引物 ,用PCR SSCP结合银染色显示结果 .结果 32例肿瘤标本检出阳性 9例 ,阳性率 2 8.1% .4例癌组织和癌旁组织均为阳性 .其中 2 2例胃癌 ,检出 4例阳性 (占 18.2 % ) ,双阳性者 2例 .结论 p5 3基因突变在肿瘤中具有普遍性 ,癌组织和癌旁组织双阳性者 ,与肿瘤的扩散有关 .该检测方法简便易行 ,有助于对 p5 3基因突变的扫描检测 .

陇东绒山羊KRTAP2-1基因鉴定及其对羊绒性状影响的研究

角蛋白关联蛋白(KAPs)是羊绒纤维的主要结构成分,但尚未在山羊基因组中鉴定出KRTAP2-1基因,本研究以人类KRTAP2-1基因为模板,在山羊基因组中进行同源性搜索,在19号染色体上发现了一个399 bp的开放阅读框。采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法,在249只陇东山羊上检测到7条不同的序列(A-G)。进化树结果表明,这7条序列与人类和绵羊的KAP2-1序列有较高的同源性,表明该序列是山羊KRTAP2-1的7个等位基因。测序结果表明,KRTAP2-1基因中存在12个单核苷酸多态性(SNPs)(5个SNPs位于编码区,7个SNPs位于非编码区),以及c.-61-63delCTC和c.9395delCCG两个碱基缺失,其中c.9395delCCG引起了第32位精氨酸的移码缺失。山羊KAP2-1蛋白含有丰富的半胱氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸。相关性分析表明,等位基因C的存在与较小的羊绒纤维直径相关(存在:13.4±0.05μm;缺失:13.6±0.03μm;P=0.010)。本研究表明,山羊KRTAP2-1基因有丰富的多态性,可作为陇东绒山羊羊绒纤维直径选育的分子标记用于生产实践。

德保矮马生长激素受体基因PCR-SSCP分析

为了研究德保矮马生长激素受体(GHR)基因的多态性,试验根据GenBank公布的马GHR基因样序列设计了9对特异性引物,PCR扩增出德保矮马GHR基因的9个外显子片段(eoxn 2～10),单链构象多态性(SSCP)分析这些片段多态性,并进行群体遗传学分析。结果表明:德保矮马GHR基因9个片段中有3个片段表现出聚合酶链式反应-单链构象多态性,即E1、E3和E5,其他6个片段无多态性。E1片段表现为3种基因型AA、GG和AG型,GG型为优势基因型,G为优势等位基因;E3片段表现出4种基因型,即AA、AC、GA和GC,GA为优势基因型,A、G为优势等位基因;E5片段表现出3种基因型,即AA、AG和GG型,GG为优势基因型,G为优势等位基因。GHR基因E1、E3、E5片段均为中度多态;E1和E3片段处于Hardy-Weinberg非平衡状态,E5处于平衡状态。

促甲状腺激素受体第三胞内环基因突变与乳头状甲状腺癌关系探讨

目的研究乳头状甲状腺癌发病是否与促甲状腺激素受体(TSHR)第三胞内环基因突变有关。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCRSSCP)及DNA测序方法,对65例乳头状甲状腺癌和44例甲状腺正常组织(对照)TSHR第三胞内环基因突变进行检测。结果经PCRSSCP检测65例乳头状甲状腺癌TSHR第三胞内环未发现明显带型异常,取2例对照组织和3例癌组织进行DNA测序,5例组织TSHR2000位点碱基均由C→T,使得所编码的601位氨基酸由组氨酸(CAT)→酪氨酸(TAT),余无明显基因突变。结论乳头状甲状腺癌发病与TSHR第三胞内环基因突变无关;中国人TSHR基因与国外人群存在多态性差异。

苯丙酮尿症患者突变基因的检测

目的 检测苯丙酮尿症(phenyl—ketonuria,简称PKU)患者的基因突变类型。方法采用PCR-SSCP(聚合酶链反应单链构象多态)银染和PCR-ASO(聚合酶链反应等位基因特异性寡核苷酸)探针杂交,分别检测了8个PKU家庭中10名患者和6名双亲。PCR—SSCP银染应用了3对引物,外显子7、11、12。PCR-ASO探针杂交应用了外显子7、10、11、12、4对探针。结果 王氏家系姐弟俩(表1中编号7,10)通过PCR-SSCP方法发现E_7区域有异常电泳带,经PCR-ASO方法证实他们和附图编号8均为苯丙氨酸羟化酶E7R243Q位点的纯合子突变;沈氏家系姐妹俩通过PCR-ASO法检出E12R413P位点为纯合子突变,另一例PKU患者为E12R413P位点的杂合子。结论 上述突变位点为PKU患者的产前基因诊断提供了依据。

敌百虫对小鼠P53基因第5～8外显子突变影响的研究

为了探讨有机磷农药敌百虫对小鼠P53基因高发突变区第5～8外显子有无致突变性,试验分别配制浓度为80,120,160 mg/L的敌百虫溶液,对昆明系小鼠进行口服染毒30 d,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术和DNA测序技术对染毒小鼠血液和组织P53基因第5～8外显子进行突变位点检测。结果表明:3个试验组共39个被检测样本P53基因第5～8外显子区域均未发生突变现象。