聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的 应用PCR SSCP技术快速检测耐INH ,RFP ,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变 ,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及 2 5株结核分支杆菌敏感分离株用PCR SSCP方法分别检测 ,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中 ,rpoB、KatG、rpsLPCR扩增产物PCR SSCP分别有 2 8株 (87.5 % )rpoB基因 ,19株 (5 9.3% )KatG基因和 2 3株 (71.9% )rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H3 7Rv电泳条带相比有明显差异 ,而 2 5株结核分支杆菌敏感株的PCR SSCP条带与结核分支杆菌H3 7Rv相似 ,特异性为 10 0 %。结论 PCR SSCP方法敏感、特异 ,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变 。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测瘢痕疙瘩成纤维细胞p53基因突变

目的 :分析瘢痕疙瘩成纤维细胞p5 3基因突变高发区第 4～ 8外显子的突变及其意义。 方法 :取手术切除的瘢痕疙瘩和非增生瘢痕各 12例 ,分别采用相应正常皮肤对照 ,体外培养成纤维细胞 ,采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术检测 p5 3基因的突变情况。 结果 :12例瘢痕疙瘩成纤维细胞标本中有 9例 p5 3基因外显子 4、5、6、7出现突变 ,非增生瘢痕标本和正常皮肤标本均未检出突变。 结论 :p5 3基因突变是瘢痕疙瘩形成和发展的重要因素之一。

聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用

目的:探讨聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收的方法在基因改变检测中的应用。方法:实验于2004-09/2005-10在南方医院心内科实验室完成。样本来源:于2004-09/2005-08选择南方医院心内科收治的冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者123例,均符合WHO冠心病诊断标准,并经心电图、超声心动图、CT确诊。患者均知情同意。聚合酶链反应-单链构象多态性银染方法检测冠心病患者三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因改变,对1例怀疑存在基因改变样本的聚丙烯酰胺凝胶采用银染后单链胶回收,以胶回收后的单链聚合酶链反应产物为模板重复聚合酶链反应后进行测序。结果:在对三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因Exon7进行单链构象多态性检测时,发现一样本泳带异常,对其样本进行银染后胶回收,结合限制性内切酶酶切,证实此样本存在碱基改变,从而验证了非变性聚丙烯酰胺凝胶银染后胶回收的准确性和可行性。结论:经聚合酶链反应-单链构象多态性银染后的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶也可进行胶回收。聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中可以增强单链构象多态性基因突变检测的准确性,由于其无毒性、成本低及操作简单等优点,更易被实验人员所接受。

聚合酶链反应-单链构象多态性分析在家族性高胆固醇血症研究中的应用

目的：探讨聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ－ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）在家族性高胆固醇血症（ｆａｍｉｌｉａｌｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ，ＦＨ）研究中的应用价值。方法：提取ＦＨ患者外周血基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及ＤＮＡ序列分析。结果：对１家２例临床诊断为ＦＨ的患儿及其父母从基因水平明确了诊断。ＬＤＬ受体基因突变是位于第６外显子的移框突变。结论：ＰＣＲ－ＳＳＣＰ可以从基因水平对ＦＨ患者明确诊断，并可对先证者家系成员早期诊断，以便提供咨询和指导。

中国汉族、布依族和壮族群体中聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1基因多态性

【目的】探讨人类聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)5个外显子核苷酸多态性。【方法】采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和银染技术检测3个民族(汉族、布依族和壮族)634名正常人PARP-1基因多态性。【结果】在3个民族634名正常人血标本的5个外显子扩增产物SSCP电泳条带中,219名汉族人PARP-1基因5个外显子均未检出多态性条带;203名布依族和212名壮族人PARP-1基因的5个外显子扩增产物中分别有2例的外显子20检出1条多态性条带,其余4个外显子扩增产物未见多态性条带。【结论】PARP-1基因第20外显子上可能存在多态性。

聚合酶链式反应偶联单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术用于鹿鞭线粒体DNA指纹的研究

目的建立一种快速、简便、准确的分子生物学方法,用来鉴别鹿鞭真伪及品种。方法应用柱色谱法提取梅花鹿鞭、马鹿鞭、牛鞭以及市售鹿鞭线粒体DNA;根据GenBank中鹿类动物线粒体细胞色素b基因序列,设计一对引物用于线粒体DNA的聚合酶链式反应(PCR)特异性扩增;应用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对聚合酶链式反应产物进行单链构象多态分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)。结果梅花鹿鞭、马鹿鞭以及部分市售鹿鞭可显示清晰且迁移率不同的片段;对照组伪品鹿鞭及部分市售鹿鞭无特异性显示。结论柱色谱法提取线粒体DNA所需时间短,DNA纯度高,DNA分子的破坏性较小,为特异性聚合酶链式反应扩增提供一级结构保证;单链构象多态分析法可以清晰显示正品梅花鹿鞭、马鹿鞭以及部分市售鹿鞭单链片段,其一级结构中的碱基差别为正品梅花鹿鞭、马鹿鞭的不同迁移率提供依据,也为药源市场鹿鞭的鉴别提供一种可以直接进行亚种间鉴别的快速、简便、准确的可行性方法。

用PCR-指纹图和PCR-单链构象多态性对骨髓移植供、受体进行HLA-D区配型

为探讨HLA血清学分型与DNA配型结果的相关性,本文建立了HLA-DQA、DQB、DPB、DRB位点聚合酶链反应-指纹图(PCR-F)、聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)配型方法,并用PCR-F、PCR-SSCP对21对骨髓供、受者进行了基因配型。与血清学结果比较,其中10对血清学配型一致的供、受体,在DQA位点PCR-F、PCR-SSCP有8对相合,在DRB位点有7对相合。提示在配型中,应用PCR-F和PCR-SSCP可发现血清学不易检测出的基因亚型。

苏姜猪Lrh-1基因PCR-SSCP多态性及其与产仔数的关系

为深入研究苏姜猪肝受体类似物质-1(Lrh-1)基因的多态性及其与产仔数性状间相关性,依据NCBI数据库中猪Lrh-1基因核酸序列设计2对引物,采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对苏姜猪Lrh-1基因进行多态性检测。检测结果显示,引物P1 PCR扩增产物存在7种SSCP条带型,共有4个碱基突变位点,分别为27287662、27287593、27287535和27287511位;引物P2 PCR扩增产物存在2种SSCP条带型,碱基突变位于27423038位;将扩增序列与猪Lrh-1CDS区进行比对分析,其中27287662、27287593和27423038位的碱基突变位于配体结合域(LBD)区内,且突变均属同义突变,表明LBD区对于Lrh-1基因功能稳定具有重要作用;不同碱基突变位点的基因频率经群体遗传学分析,除27287511位点处于群体不平衡状态(P<0.05)外,其他位点均达群体平衡状态(P>0.05);Lrh-1基因P1和P2扩增区SSCP不同类型苏姜猪第1胎和第2胎平均产仔数间无显著差异(P>0.05)。

绵羊LHR基因PCR-SSCP多态性与繁殖性状的关联分析

通过聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析方法检测绵羊品种(湖羊、晋中绵羊和陵川半细毛羊)促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)基因外显子11核酸序列的单核苷酸多态性,并研究该基因多态性对湖羊性早熟和产羔数的影响。结果表明:在6对引物扩增产物中,只有引物P2和P6的扩增片段具有多态性,引物P2扩增区存在2种基因型,分别为LL和LM型,在3个绵羊品种中均未检测到MM型;引物P6扩增区存在6种不同的SSCP带型,经序列比对分析存在T2053A、A2044T和G2003A的错义突变。湖羊和晋中绵羊P2扩增区基因型分布差异不显著(P>0.05),而与陵川半细毛羊均存在极显著差异(P<0.01);P6扩增区的2 053、2 044、2 003位点各基因型分布在湖羊和晋中绵羊间差异不显著(P>0.05),而与陵川半细毛羊间存在显著差异。P2扩增位点仅陵川半细毛羊的基因分布不符合哈迪-温伯格定律;P6扩增区湖羊和晋中绵羊在各突变位点的等位基因频率处于群体平衡状态,陵川半细毛羊除2 003突变位点基因分布处于群体不平衡状态外,其余突变位点的等位基因频率分布符合哈迪-温伯格定律;LHR外显子11区不同基因型湖羊各胎次产羔数差异不显著(P>0.05),表明LHR外显子11对湖羊的性早熟和高繁殖力性状没有显著影响。

5种食源致病菌16SrRNA基因单链构象多态性分析

目的 对 5种常见食物中毒致病菌 16SrRNA基因单链构象多态性 (Single -strand -conformationpolymor phism ,SSCP)进行分析 ,探讨该技术在食物中毒致病菌快速鉴别诊断中的可能作用。方法 5种常见食源性致病菌标准株增菌后 ,提取DNA ,通过特异引物对菌株的 16SrRNA序列的可变区进行扩增 ,扩增产物进行SSCP分析。结果 各菌株均分离出两条或以上特异性条带 ,条带间距离及相对位置差异明显 ,并有良好的重复性。该方法的灵敏度可达10～ 15个鼠伤寒沙门菌细胞。结论 5种常见食物中毒致病菌 16SrRNA基因单链构象多态性具有种属特异性 ,PCR-SSCP分析法有助于快速、准确的从基因水平上对食物中毒致病菌进行分析检测。

猪品种ESR和PRLR基因的PCR-SSCP多态性分析

采用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法,对国外引进猪品种杜洛克猪、长白猪、大约克夏猪和东北地方猪品种东北民猪、丹东黑猪共计305头母猪进行了雌激素受体基因(Estrogen receptor gene,ESR)和催乳素受体基因(Prolactin receptor gene,PRLR)的多态性检测,并对其遗传多样性进行了分析。结果表明,两个基因位点在5个猪品种中均存在着多态性,5个猪品种的ESR基因和PRLR基因位点的期望杂合度分别在0.2581～0.4967和0.4007～0.4885,多态性信息含量分别在0.2248～0.3734和0.3204～0.3692。各个猪品种均表现出了中度的多态性。

中国家驴TYRP1基因第二内含子多态性分析

为了探究TYRP1基因对中国家驴毛色的影响,试验采集410只不同毛色中国家驴的血液样本,采用聚合酶链式反应及单链构象多态性(polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)方法检测中国家驴TYRP1基因第二内含子中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,对不同毛色中国家驴个体进行基因分型,并计算基因型频率和等位基因频率,分析TYRP1基因第二内含子多态性与中国家驴不同毛色之间的关系。结果表明:在中国家驴TYRP1基因第二内含子中检测到1个SNP位点(g.1 702A→G),该位点存在AA、AG、GG三种基因型;乌头、黑三粉、青三粉、灰三粉、白色和白化家驴的优势等位基因均为A。乌头、黑三粉和青三粉均为AA基因型频率最高,GG基因型频率最低;灰三粉为AA基因型频率最高,AG基因型频率最低(0)。在乌头、黑三粉、青三粉、灰三粉家驴中,AA基因型频率为灰三粉最高,然后依次为青三粉、黑三粉和乌头;以黑毛色为主色调的家驴(乌头、黑三粉、青三粉)GG基因型频率低于以灰毛色为主色调的家驴(灰三粉),有白毛混杂的黑三粉和青三粉的GG基因型频率低于纯黑的乌头。样本中的白色家驴和白化家驴各有2头,其基因型均为AA纯合子。说明随着中国家驴黑色被毛比例的增加,TYRP1基因g.1 702A→G位点的AA基因型频率逐渐降低,推测该位点可能与中国家驴毛色性状有关。

应用聚合酶链反应-单链构象多态性技术分析结节性硬化症基因突变

目的 检测结节性硬化症基因外显子突变。方法 应用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分析 2 8例结节性硬化症患者TSC1和TSC2基因外显子突变情况。结果 2 8例中有 4例发生TSC1基因突变 ,其中包括 1个无义突变、2个错义突变和 1个移码突变 ;有 13例患者发生TSC2基因突变 ,其中包括 2个无义突变、2个移码突变、1个缺失和 8个错义突变。有 2例患者在TSC1及TSC2基因上均发生突变 ,另有 2例患者在TSC2核苷位 1960上出现同样突变。TSC1突变患者和TSC2突变患者之间临床表现无明显差异。结论 突变广泛分布于TSC1及TSC2基因各个外显子上 ,没有集聚于某个外显子 。

威灵仙的聚合酶链反应-单链构象多态性方法鉴别研究

目的利用聚合酶链反应-单链构象多态性方法(PCR-SSCP)技术建立一种快速、准确鉴别威灵仙药材基原的方法。方法查找Genbank上注册的威灵仙药材基原的内转录间隔区(ITS)序列,进行序列的比对分析,确定稳定的特异鉴别位点。据此设计能扩增包含特异鉴别位点的短片段引物,采用聚合酶链反应-单链构象多态性方法对威灵仙药材基原进行鉴定。结果不同威灵仙基原的聚合酶链反应-单链构象多态性方法谱带带型存在明显差异。结论聚合酶链反应-单链构象多态性方法方法能够快速、准确地鉴别威灵仙药材基原,为进一步开展威灵仙药材的准确鉴定奠定基础。

利用PCR-SSCP技术检测中国汉族人PKD2基因的突变

目的：检测中国汉族人Ⅱ型多囊肾病基因PKD2的突变。方法：筛选临床确诊的26个中国汉族家系中31例常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）患者，提取外周血白细胞DNA，应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR－SSCP），取异常条带标本进行核苷酸序列测定，判别PKD2外显子突变位置及类型。结果：以20例健康志愿者为对照，从31例患者中成功检测出2种突变。1种为无义突变，系PKD2外显子13的第2407位碱基由胞嚼陡置换为胸腺嘧啶，形成1个终止密码子；另1种为错义突变，系PKD2外显子4的第964位碱基由胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，使编码氨基酸由精氨酸变为色氨酸。结论：本研究建立了PCR－SSCP直接检测我国汉族人PKD2突变方法，检测出2种基因突变，为今后开展ADPKD患者囊肿前诊断提供了实验基础。

绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化

为进行绵羊PRNP等位基因密码子136、154、171的多态性研究,建立适合于绵羊PRNP等位基因开放阅读框(ORF)内高变区PCR-SSCP分析方法,对凝胶浓度、交联度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液浓度、上样量等影响因素进行了优化试验。在优化中引入了正交试验法,以使优化过程简化,结果可靠。结果表明,交联度49∶1、甘油浓度0%、凝胶浓度12%、电泳电压200 V、PCR产物上样量≥2.0μL且<4.0μL、PCR产物与变性缓冲液比例1∶4、0.5×TBE缓冲液及4℃电泳45 h为最佳试验条件,据此建立了绵羊PRNP等位基因136、154、171密码子的PCR-SSCP分析方法。

德保矮马生长激素受体基因PCR-SSCP分析

为了研究德保矮马生长激素受体(GHR)基因的多态性,试验根据GenBank公布的马GHR基因样序列设计了9对特异性引物,PCR扩增出德保矮马GHR基因的9个外显子片段(eoxn 2～10),单链构象多态性(SSCP)分析这些片段多态性,并进行群体遗传学分析。结果表明:德保矮马GHR基因9个片段中有3个片段表现出聚合酶链式反应-单链构象多态性,即E1、E3和E5,其他6个片段无多态性。E1片段表现为3种基因型AA、GG和AG型,GG型为优势基因型,G为优势等位基因;E3片段表现出4种基因型,即AA、AC、GA和GC,GA为优势基因型,A、G为优势等位基因;E5片段表现出3种基因型,即AA、AG和GG型,GG为优势基因型,G为优势等位基因。GHR基因E1、E3、E5片段均为中度多态;E1和E3片段处于Hardy-Weinberg非平衡状态,E5处于平衡状态。

4种食源性致病菌的PCR-SSCP检测技术研究

采用细菌的16S rDNA保守区引物作为通用引物,对常见食源性致泻大肠埃希氏菌(Diarrheogenic Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonellae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)进行PCR扩增,产物及其XmnI酶切后产物进行单链构象多态性分析。试验结果显示,4种食源性致病菌的PCR产物经XmnI酶切后进行单链构象多态性分析可以相互区别。因此,PCR-SSCP技术可以方便地用于检测食源性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。