应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳和16S rDNA技术分析果冻胀气原因

目的分析某品牌果冻胀气的原因。方法提取胀气果冻总DNA,采用聚合酶链式反应-变性度凝胶电泳技术(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)进行菌群结构分析,同时采用平板分离法从果冻中分离细菌。并将分离得到的菌株进行16S rDNA扩增和测序比对分析。将分离的菌株接种到正常果冻中进行产气实验。结果 PCR-DGGE和平板分离结果表明,在胀气果冻中分别只检测到一种细菌,未检测出真菌。测序比对结果表明该细菌属于芽孢乳杆菌属。将该菌接种到正常果冻中会引起果冻胀气。结论芽孢乳杆菌是导致该品牌果冻胀气的主要因素。

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳在环境微生物中的应用

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境微生物学中微生物群落多样性、动态性分析和功能细菌的跟踪。阐述了PCR-DGGE的原理与方法,分析了其在环境微生物学中的应用,并对其应用前景进行了展望。

聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析在毒死蜱胁迫下土壤真菌群落结构演替

为评价毒死蜱施用后对土壤真菌群落结构的影响,将农田土壤用终质量分数5mg/kg毒死蜱处理,同时以不施用毒死蜱为对照,定期采集土样进行毒死蜱残留测定并提取土壤DNA,采用基于染色体内转录间隔区(internaltranscribed spacers,ITS)ITS1f-GC/ITS2和28SrDNA U1-GC/U2引物对进行聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳,获得的指纹图谱利用Quantity One软件进行数字化分析,计算样品的多样性指数(H),并用Matlab软件进行主成分分析.ITS1f-GC/ITS2和U1-GC/U2扩增区域分析结果表明,毒死蜱施用后第7～60天内土壤真菌群落结构与对照相比发生很大改变,且毒死蜱处理样品真菌群落结构保持基本稳定,多样性指数明显提高;主成分分析显示,毒死蜱处理样品与对照明显分在2个不同的区域,充分表明毒死蜱对土壤真菌群落结构影响迅速且持久.

聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳技术研究梯田式人工湿地微生物群落动态变化

采用聚合酶链反应(PCR)—变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对梯田式人工湿地(TTCW)和复合垂直流式人工湿地(IVCW)生活污水处理系统内的微生物群落结构的动态变化及其对生活污水处理效果的影响进行了对比研究。结果表明:(1)TTCW和IVCW对生活污水均具有较好处理效果,其COD去除率平均分别为76.2%和72.6%、TP去除率平均分别为90.7%和85.6%、NH4+-N去除率平均分别为65.2%和58.8%;TTCW增氧作用明显。(2)2种人工湿地内均存在丰富的微生物群落,并均存在共有的微生物种群;在湿地沿程不同位置均存在一定数量的优势种群。(3)TTCW强化了大气复氧能力,使得湿地内DO较相同深度的IVCW的高。TTCW具有较强的污染物去除能力,特别是具有高效的脱氮除磷能力。这种能力可能主要是TTCW中微生物群落结构的变化所致。

冷却牦牛肉贮藏过程中优势菌的PCR-变性梯度凝胶电泳分析

应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究托盘保鲜膜包装的冷却牦牛肉在4℃贮藏过程中的微生物多样性及其动态变化。直接从样品中提取细菌总的DNA,采用降落PCR扩增16S rDNA的V3可变区序列,再通过DGGE得到动态变化的指纹图谱,并对主要条带进行测序分析。结果表明:检测到的优势腐败菌为Pseudomonas sp.(假单胞菌)、Lactococcus sp.(乳球菌)、Acinetobacter sp.(不动杆菌)、Brochothrix thermosphacta(热死环丝菌)、Enterobacteriaceae bacterium(肠杆菌科细菌),此外还检测到Uncultured Citrobacter sp.(非培养的柠檬酸杆菌)和Staphylococcus sp.(葡萄球菌)。

变性梯度凝胶电泳在环境微生物研究中的应用详解

结合笔者等多年积累的经验详细介绍环境微生物学研究中变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术应用全步骤:从环境样品中直接提取总DNA,利用5′端含GC夹子的引物PCR 16S rDNA的部分片段,将PCR产物在含有浓度线形递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析,使不同来源的DNA片段在电泳胶中分离,从胶中切出分离的DNA片段测定碱基序列,进行分类分析。PCR-DGGE技术能够检测不可培养的微生物基因,而DGGE技术与克隆等其他技术结合更能发挥其分离作用。

常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析

为了解我国典型有毒有害赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱以及DGGE技术在赤潮藻类分析鉴定中的作用,本课题组运用DGGE技术,研究了我国沿海7种重要赤潮藻类的单一种类以及混合种类样品的18S rDNA V3区的DGGE指纹图谱,并且对2009年10月底在广东省珠海海域发生的双胞旋沟藻(Cochlodini-um geminatum)赤潮样品进行了DGGE分析.结果表明,DGGE技术能够对环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻、中肋骨条藻、塔玛亚历山大藻、双胞旋沟藻7种常见的海洋赤潮藻类具有较好的区分效果,同时监测出赤潮样品中双胞旋沟藻、血红哈卡藻、环节环沟藻和海洋原甲藻4种优势种,种类组成与显微镜观察结果具有较好的一致性.结果说明DGGE技术可作为一种辅助方法对赤潮藻类进行分类鉴定.

嗜酸性细菌浸出废旧线路板过程中微生物群落的聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳分析

以富集的嗜酸性细菌为接种物，进行废旧线路板的生物浸出实验，同时收集浸出不同时间的微生物样品，利用聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳技术分析了浸出过程中微生物群落结构的变化．结果表明，嗜酸性细菌能在48h内浸出废旧线路板中96．36％的铜．从变性梯度凝胶上挑选的明亮条带分析结果显示，Z1-Z7七个条带序列与氧化亚铁硫杆菌叫cidithiobacillusferrooxidans）的序列同源性均在99％以上，即均为Acidithiobacillusferrooxidans．浸出0，5，24和60h的样品中ZI~Z7的组成比例变化不大，其中Z3相对丰度一直最高，分别为72．70％．82．90％，79．00％和85．80％．浸出过程中微生物群落结构演变较平缓，始终为Acidithiobacillusferrooxidans菌群，菌株Z3是整个浸出过程中的优势菌种．

基于PCR-DGGE技术分析浓香白酒窖泥梭菌多样性

窖泥是浓香型白酒酿制过程中最主要的微生物源,窖泥中微生物的类型、丰度、新陈代谢活动等均对浓香型白酒品质产生很大的影响。为探究窖泥中梭菌微生物的多样性,利用窖泥理化结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对10个窖泥样品中的梭菌群落及变化规律进行研究。结果表明,所选10个窖泥的理化参数均符合优质窖泥指标要求;在微生物层面,窖泥中检测到的梭菌在属水平上有:嗜碱菌属、丁酸弧菌属、梭菌属、喜热菌属、瘤胃梭菌属、粪球菌属、沉淀杆菌属(Sedimentibacter)、钙原杆菌属(Caldicoprobacter)、温带菌(Tepidimicrobium)、梯氏菌(Tissierella)、孢子菌(Sporanaerobacter)、硫酸盐还原菌属、鲁替孢菌属和梭状芽胞杆菌(Clostridiisalibacter)等,这些菌是优质窖泥的重要指示菌,可知窖泥中含有极其丰富的酿酒功能菌。揭示了可能在白酒酿造中起关键作用的梭菌菌群,在分子水平上为研究浓香型白酒提供了理论依据。

PCR-DGGE解析阴离子交换膜生物反应器反硝化过程中微生物群落结构变化

通过扫描电镜和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法考察了进水NO3-浓度变化对阴离子交换膜生物反应器微生物种群结构的影响。研究结果表明,在进水NO3-浓度从47.01 mg/L逐渐增加到168.55 mg/L的过程中,出水中NO3--N浓度满足我国饮用水水质标准中小于10 mg/L的要求。电镜扫描图显示微生物的形态结构发生了很大变化。对不同阶段的样品进行PCR-DGGE图谱和相似系数分析,发现随着反应的持续进行,微生物种群结构发生了演替变化,证实污泥微生物生态能够迅速进行优胜劣汰的筛选,调整内部微生物种群结构,从而达到适应环境的目的。

中国人2型糖尿病肾病患者锰超氧化物歧化酶基因的PCR-DGGE分析

目的探讨锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因在中国人糖尿病肾病(DN)遗传背景中的地位.方法运用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术在200例无亲缘关系之中国云南昆明地区汉族人2型糖尿病肾病患者90例;2型糖尿病患者70例;健康对照者40例中对MnSOD基因编码区进行分子扫查.结果在对研究对象MnSOD基因编码区的第1、2、3、4、5个外显子的PCR-DGGE扫查中未发现异常泳动片段.结论 MnSOD基因可能不是中国汉族人DN的主要致病基因.

中山市生鲜畜禽肉中变形杆菌的污染分布及ERIC-PCR分型

调查中山市某菜市场生鲜畜禽肉中变形杆菌的污染情况,分析占优势的奇异变形杆菌的亲缘关系。采集268份生鲜畜禽肉样品,使用聚合酶链式反应检测和生化实验的方法对污染的变形杆菌进行分离鉴定,并利用肠杆菌基因间保守重复共同系列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction,ERIC-PCR)技术对分离的奇异变形杆菌进行分子分型及同源性分析。结果表明:所有类型的样品受变形杆菌污染严重,程度由大到小依次为鸡肉、鸭肉和猪肉;PCR与生化鉴定结果一致,共检出123株变形杆菌,变形杆菌阳性携带率为51.6%,其中117株为奇异变形杆菌;ERIC-PCR指纹图谱条带均为3~9条,呈现良好的多态性;101株奇异变形杆菌集中分布在E、I、K簇,簇内相似性大于70%。ERIC-PCR技术适用于奇异变形杆菌的分型及同源性研究,对变形杆菌引起的食品污染和亲缘性溯源具有重要意义。

喉癌组织中环氧化酶-2（COX-2）基因表达的实时定量PCR研究

测定环氧化酶-2（COX-2）mRNA在喉鳞癌组织中的含量，并分析COX-2 mRNA与喉鳞癌临床分期及组织分化程度的关系。用序列特异性引物和荧光染料SYBR greenⅠ聚合酶链式反应（PCR）方法，检测30例原发性喉鳞癌和癌旁组织中COX-2mRNA表达，采用GAPDH作对照。结果，30份标本的扩增产物经熔解曲线分析及DNA琼脂糖凝胶电泳，证实均为COX-2。COX-2mRNA在喉鳞癌中的阳性率是100％，而在癌旁组织阳性率为40％（12／30例），NCOX分别为（16．54±13．27）、（9．24±6．91），两者之间差异有显著性意义（P〈0．05），且喉癌组织中的COX-2mRNA表达水平与喉癌组织分化程度及临床分期密切相关。结果表明，应用荧光染料SYBR greenⅠ的实时定量PCR技术能够对COX-2基因表达水平进行定量分析，COX-2基因表达的上调与喉癌的发生有关，且可以作为一种有效的喉癌分子标志。

PCR-DGGE分析四川地区家庭制作泡菜中微生物多样性

以四川家庭制作泡菜为研究对象,通过聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳结合(PCR-DGGE)指纹图谱技术分析样品中微生物群落结构,对典型条带进行系列分析,并构建系统发育进化树。结果表明:四川家庭制作泡菜中的细菌种类比较丰富,真菌在泡菜中存在相对较少。细菌中乳杆菌属(Lactobacillus)是优势种群,非培养细菌(uncultured bacteria)是次优势种群,分别占总数的56%和32%,其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在泡菜发酵中发挥着重要的作用;主要真菌为(Meyerozyma guilliermondii)和奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)的近缘种。

PCR-DGGE技术在城市污水化学生物絮凝处理中的特点

通过PCR DGGE等分子生物学技术可以不经过常规培养直接从活性污泥和生物膜样品中提取DNA ,对 16SrDNAV3区进行PCR扩增 ,结合DGGE(变性梯度凝胶电泳 ) ,从而分析活性污泥与生物膜中微生物种群结构 .研究证实 ,活性污泥培养前后微生物种群结构发生很大的改变 .同时对 2种污水处理工艺中微生物种群结构进行了对比研究 ,对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨 .测定了活性污泥中部分菌种的 16SrDNAV3区片段序列 ,通过NCBI(美国国立生物技术信息中心 )基因库比对 ,初步确定细菌的属 .结果显示 ,PCR

基于PCR-DGGE分析不同品牌郫县豆瓣酱真菌多样性

以不同品牌的郫县豆瓣酱为研究对象,通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳免培养技术分析样品中微生物真菌菌群结构,并对典型条带进行测序,构建系统发育进化树。结果表明:郫县豆瓣酱真菌菌群种类较丰富,不同品牌的郫县豆瓣酱真菌菌群既包含共有菌群又存在一定差异。假丝酵母(Candida sp.)、曲霉(Aspergillus)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、奥默柯达酵母菌(Kodamaea ohmeri)是优势种群,尤其是黄曲霉(Aspergillus flavus)共有10个条带,占整个测序条带32.25%,表明郫县豆瓣酱的生产应特别注意防控黄曲霉。

PCR-DGGE分析天源酱园豆酱发酵过程中微生物多样性

以天源酱园生产豆酱为研究对象,通过PCR-DGGE指纹图谱技术分析豆酱发酵过程中微生物群落动态变化。结果表明:豆酱发酵过程中的优势细菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,相似率98%)和未培养明串珠菌克隆(uncultured Leuconostoc sp.clone,相似率100%)的近缘种,其中芽孢杆菌协助真菌分解原料中蛋白质和淀粉,明串珠菌有助于豆酱风味物质的形成;豆酱发酵过程中主要真菌为米曲霉(Aspergillus oryzae,相似率99%)的近缘种,在豆酱发酵前期分解原料中蛋白质和淀粉。

芽孢杆菌在肉鸡肠道内的分布及对肠道菌群、消化酶活性的影响

考察枯草芽孢杆菌的芽孢在AA肉鸡肠道内的分布和随粪便的排出规律,及对肠道内细菌群落结构变化和肠道内消化酶活性的影响.试验选取240羽1日龄AA肉鸡,随机分为2组,每组6个重复,采用相同的无抗生素基础日粮饲养3 d后,对照组和试验组分别一次性灌喂无菌水或枯草芽孢杆菌的芽孢(1.5×108CFU?mL-1)各0.5 mL;在不同时间采样进行计数和酶活性测定,同时通过聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术分析此过程肉鸡粪便中细菌群落的变化.结果表明:灌喂的芽孢在十二指肠内开始萌发,以空肠的营养体数量最高,盲肠内则以芽孢为主;粪便中的芽孢数量在24 h时最高,达到7.9×104CFU?g-1,而后逐渐降低,在72 h后基本无法检出.PCR-DGGE结合主成分分析(PCA)表明:对照组与试验组鸡粪中的细菌群落结构存在较大差异,其中试验组中肠道有益菌——乳杆菌属(Lactobacillussp.)含量较对照组有明显提高;同时,灌喂芽孢12 h后,十二指肠内淀粉酶、胰蛋白酶和总蛋白酶活性,空肠内的脂肪酶活性和盲肠内的总蛋白酶活性均高于对照,差异有统计学意义(P<0.05).试验证实芽孢能在AA肉鸡肠道内萌发并停留超过72 h,并对提高肠道内消化酶活性和改善菌落结构发挥作用.