聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析在毒死蜱胁迫下土壤真菌群落结构演替

为评价毒死蜱施用后对土壤真菌群落结构的影响,将农田土壤用终质量分数5mg/kg毒死蜱处理,同时以不施用毒死蜱为对照,定期采集土样进行毒死蜱残留测定并提取土壤DNA,采用基于染色体内转录间隔区(internaltranscribed spacers,ITS)ITS1f-GC/ITS2和28SrDNA U1-GC/U2引物对进行聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳,获得的指纹图谱利用Quantity One软件进行数字化分析,计算样品的多样性指数(H),并用Matlab软件进行主成分分析.ITS1f-GC/ITS2和U1-GC/U2扩增区域分析结果表明,毒死蜱施用后第7～60天内土壤真菌群落结构与对照相比发生很大改变,且毒死蜱处理样品真菌群落结构保持基本稳定,多样性指数明显提高;主成分分析显示,毒死蜱处理样品与对照明显分在2个不同的区域,充分表明毒死蜱对土壤真菌群落结构影响迅速且持久.

PCR-DGGE解析阴离子交换膜生物反应器反硝化过程中微生物群落结构变化

通过扫描电镜和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法考察了进水NO3-浓度变化对阴离子交换膜生物反应器微生物种群结构的影响。研究结果表明,在进水NO3-浓度从47.01 mg/L逐渐增加到168.55 mg/L的过程中,出水中NO3--N浓度满足我国饮用水水质标准中小于10 mg/L的要求。电镜扫描图显示微生物的形态结构发生了很大变化。对不同阶段的样品进行PCR-DGGE图谱和相似系数分析,发现随着反应的持续进行,微生物种群结构发生了演替变化,证实污泥微生物生态能够迅速进行优胜劣汰的筛选,调整内部微生物种群结构,从而达到适应环境的目的。

石化废水处理系统微生物群落结构PCR-DGGE分析

为提高石油化工污水厂厌氧—好氧(A/O)工艺净化效能,应用聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)与常规技术相结合的方法分析了石化废水处理系统生化池中微生物群落结构变化与污染负荷和主要污染物降解效果变化的关系。结果表明:在每天2次,连续6天的监测中,待处理废水中COD负荷在424.92 mg/L和559.10 mg/L之间波动,NH3-N在63.60 mg/L和100.87 mg/L之间变化;工艺对COD和NH3-N的去除率较低,分别为69.42%和31.2%,且生化池各段对COD和NH3-N的去除率变化并非呈单一递减趋势,这与微生态细菌种类随污水浓度的变化呈非单一的递减趋势相一致;PCR-DGGE图谱中各处理单元的细菌条带数量变化很大,相似性系数最高为36.11%,最低为6.25%,微生物群落结构相似性很低。

基于PCR-DGGE分析宣威火腿的细菌群落结构

以不同加工年份(1年、2年和3年)的宣威火腿为对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis,PCR-DGGE)技术,通过PCR扩增、优势条带切胶、克隆测序等研究不同加工年份宣威火腿表面及内部的细菌群落结构及多样性,为进一步研究宣威火腿品质提供理论依据。结果表明:马胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌、戊糖葡萄球菌等葡萄球菌属以及嗜盐四联球菌、变异微球菌等是宣威火腿中的主要细菌,其中葡萄球菌属和嗜盐四联球菌分别为宣威火腿中的优势菌属与优势菌种;宣威火腿中还检测出了未培养细菌。多样性分析表明,加工3年的宣威火腿表面细菌群落多样性最高,加工1年火腿表面细菌群落多样性最低。加工3年火腿内部细菌群落多样性最高,加工2年火腿内部细菌群落多样性最低。

基于PCR-DGGE分析云南牛干巴的细菌群落结构

以黄牛后腿肉为原料,采用传统工艺加工云南牛干巴,分别在腌制前、腌制中期、腌制后期、成熟1个月、成熟2个月与成熟3个月6个加工阶段取样,应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis,PCR-DGGE)技术分析不同加工阶段牛干巴的细菌群落结构及多样性差异。结果表明:牛干巴具有较为丰富的细菌多样性,同时存在明显的优势种群结构变化。腌制阶段的细菌种类最为丰富;腌制前与腌制后的样品中细菌群落结构差异明显,同一阶段细菌群落结构组成类似;存在于牛干巴加工过程中的细菌主要为葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌(Psychrobacter)及明串珠菌属(Leuconostoc)等,其中肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(L.mesenteroides subsp.dextranicum)是优势菌种;此外,牛干巴加工过程中还存在着不可培养(unculturable bacterium)的菌群。

嗜酸性细菌浸出废旧线路板过程中微生物群落的聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳分析

以富集的嗜酸性细菌为接种物，进行废旧线路板的生物浸出实验，同时收集浸出不同时间的微生物样品，利用聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳技术分析了浸出过程中微生物群落结构的变化．结果表明，嗜酸性细菌能在48h内浸出废旧线路板中96．36％的铜．从变性梯度凝胶上挑选的明亮条带分析结果显示，Z1-Z7七个条带序列与氧化亚铁硫杆菌叫cidithiobacillusferrooxidans）的序列同源性均在99％以上，即均为Acidithiobacillusferrooxidans．浸出0，5，24和60h的样品中ZI~Z7的组成比例变化不大，其中Z3相对丰度一直最高，分别为72．70％．82．90％，79．00％和85．80％．浸出过程中微生物群落结构演变较平缓，始终为Acidithiobacillusferrooxidans菌群，菌株Z3是整个浸出过程中的优势菌种．

PCR-DGGE分析绍兴黄酒麦曲中细菌群落方法的建立

利用垂直电泳及时间间歇法初步确立了变性剂的梯度范围和电泳时间,首次建立了聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)法分析绍兴黄酒机制生麦曲和熟麦曲中细菌群落结构的电泳条件。机制生麦曲的变性剂梯度范围为50%～65%,电泳时间为5～5.5h;熟麦曲的变性剂梯度范围为40%～60%,电泳时间为4.5～5h。DGGE条带经切胶回收、重新扩增、T-A克隆及DNA测序后,鉴定结果显示绍兴黄酒麦曲中存在糖多孢菌、肠杆菌、棒形杆菌等多属种细菌,并且从熟麦曲中鉴定到的细菌种类都包含于机制生麦曲中的细菌群落,表明不同工艺的黄酒麦曲其细菌群落结构存在着一定的差异。研究结果丰富了对绍兴黄酒麦曲中细菌群落的认识,为进一步剖析细菌在黄酒发酵中的作用奠定一定的基础。

常温CANON反应器内微生物群落结构及生物多样性

为研究基于亚硝化的全程自养脱氮(CANON)工艺中微生物群落结构及种属特征,从常温条件下稳定运行的CANON反应器中采集生物膜样品,并基于聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,分别对总细菌、氨氧化细菌和厌氧氨氧化菌进行群落结构解析.结果表明:反应器中与亚硝化作用有关的功能菌为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira),与厌氧氨氧化作用有关的功能菌是Candidatus Brocadia属和CandidatusKuenenia属,未检测到亚硝酸盐氧化细菌,且系统内氨氧化细菌的生物多样性明显高于厌氧氨氧化菌.此外,反应器中还存在其他微生物,如Shewanella、Pseudomonas、Ignatzschineria、Dechloromonas以及属于Clostridia、α-Proteobacteria、Bacillales的uncultured bacteium等.

基于PCR-DGGE技术分析浓香白酒窖泥梭菌多样性

窖泥是浓香型白酒酿制过程中最主要的微生物源,窖泥中微生物的类型、丰度、新陈代谢活动等均对浓香型白酒品质产生很大的影响。为探究窖泥中梭菌微生物的多样性,利用窖泥理化结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对10个窖泥样品中的梭菌群落及变化规律进行研究。结果表明,所选10个窖泥的理化参数均符合优质窖泥指标要求;在微生物层面,窖泥中检测到的梭菌在属水平上有:嗜碱菌属、丁酸弧菌属、梭菌属、喜热菌属、瘤胃梭菌属、粪球菌属、沉淀杆菌属(Sedimentibacter)、钙原杆菌属(Caldicoprobacter)、温带菌(Tepidimicrobium)、梯氏菌(Tissierella)、孢子菌(Sporanaerobacter)、硫酸盐还原菌属、鲁替孢菌属和梭状芽胞杆菌(Clostridiisalibacter)等,这些菌是优质窖泥的重要指示菌,可知窖泥中含有极其丰富的酿酒功能菌。揭示了可能在白酒酿造中起关键作用的梭菌菌群,在分子水平上为研究浓香型白酒提供了理论依据。

普洱茶固态发酵过程中微生物群落结构及变化

以少量茶叶发酵制备普洱茶过程中的茶叶样品为研究对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCRDGGE)技术分别对茶叶中细菌16S rRNA和真菌18S rRNA的PCR产物进行分离,根据基因指纹图谱分析群落结构及其动态变化过程,并对细菌和真菌的主要优势条带进行克隆、测序、构建系统发育树。结果表明:茶叶堆表和堆芯的微生物群落结构差异小;在发酵过程中,细菌和真菌的种类均在二翻时迅速增加,群落结构产生显著变化;而后不同种类的数量随着发酵时间的推进有规律地增加或减少,最后趋于稳定。黑曲霉是发酵前期的优势菌种,芽孢杆菌属和Arxula adeninivorans是普洱茶发酵后期的主要优势菌群。

氮肥对稻田土壤反硝化细菌群落结构和丰度的影响

以氮肥田间定位试验为研究对象,利用PCR-DGGE(聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳)和荧光定量PCR(real-time PCR)技术,通过对反硝化细菌nirS基因的检测,分析了定位试验第2年稻田反硝化细菌群落结构和丰度的变化。DGGE图谱及依据其条带位置和亮度数字化数值进行的主成分分析(PCA)结果均显示:在氮肥定位试验第2年,与不施肥对照(CK)比较,在水稻各个生育期(分蘖期、齐穗期和成熟期)内,施用氮肥[150kg(N)·hm-2]的稻田根层土或表土中的反硝化细菌群落结构均无明显变化;且稻田根层土或表土中的反硝化细菌群落结构在水稻各个生育期间也均无明显差异。荧光定量PCR结果显示,在水稻生长发育过程中,施用氮肥的稻田根层土或表土中的反硝化细菌nirS基因拷贝数始终显著(P<0.05)高于其对应的不施肥对照。此外,无论施用氮肥与否,根层土中的反硝化细菌nirS基因拷贝数在水稻成熟期时都会显著(P<0.05)降低;但表土中的nirS基因拷贝数在水稻各生育期间无明显变化;且水稻成熟期时施用氮肥和不施肥的稻田表土中nirS基因拷贝数都显著(P<0.05)高于根层土。同时,与对照比较施用氮肥可促进水稻增产44%。研究表明,短期定位试验中施用氮肥能够显著提高稻田土壤反硝化细菌的丰度,但对其群落结构没有明显影响。

降解2-氯酚厌氧污泥中微生物种群结构研究

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究Fe2+,Ni2+金属离子对经2-氯酚(2-CP)驯化后的厌氧生物反应器颗粒污泥的微生物种群结构的影响.结果表明,经2-CP驯化后,厌氧体系微生物多样性减少,产生了能适应或降解2-CP的主要菌群发光杆菌属、埃希氏菌属和志贺氏菌属.投加Fe2+,Ni2+后,降解2-CP的厌氧污泥微生物多样性均呈减少趋势,其中,加Fe2+后的厌氧体系微生物多样性明显减少,并产生新的条带,经分析,证明为专性厌氧梭菌属.

PCR-DGGE研究热鲜肉贮藏过程中的菌相变化

应用传统微生物培养和聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法研究热鲜肉分别在5、15、25、30℃贮藏过程中的菌相变化。将热鲜肉贮藏于一定温度,每隔适当时间取出,测定菌落总数,并提取细菌DNA,进行PCR-DGGE分析。细菌计数结果表明,热鲜肉贮藏于5、15、25、30℃时,菌落总数分别在约14d、75h、19h和16h达到最小腐败量7.2(lg(CFU/g))。PCR-DGGE结果表明,热鲜肉在不同温度下贮藏时,贮藏末期优势腐败菌并不一致。在贮藏过程中主要优势腐败菌有巨大球菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属、柠檬酸细菌属、不动杆菌属和埃希氏菌属。

PCR-DGGE技术及其在食品菌相分析中的应用

传统培养、鉴定的方法研究微生物菌相变化的缺点突出,不易对微生物的变化情况进行实时的分析。近年来,使用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)分析食品中菌群变化情况的优点逐渐突显。本文介绍了PCR-DGGE技术的原理、优点和缺点,以及在食品菌相研究中的应用,并对该技术在食品微生物研究中的前景进行了展望。

SBR系统驯化过程的微生物群落结构变化

采用三角瓶摇床振荡培养,模拟序列间歇式活性污泥法(SBR)处理经微电解预作用后的皮革废水,考察驯化过程中微生物群落结构的变化情况.提取驯化过程中4个不同阶段混合菌群总DNA,采用降落式聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳技术,对细菌16S rDNA V3区进行扩增和产物分离,并比较驯化过程中的微生物群落结构.结果表明,微生物群落结构和种群数量在驯化过程中存在明显的演替过程,不同微生物种群通过协同和竞争作用,最终形成一种具有新功能,性质稳定的群落结构.

两种不同硝化类型反应器中固定化硝酸菌的群落分析

该试验从亚硝化和全程硝化两种不同硝化类型的好氧流化床反应器的固定化包埋颗粒中提取细菌总基因组DNA,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对系统中的氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和亚硝酸盐氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)群落结构进行了解析,根据序列数据进行同源性分析并建立系统发育树。结果表明:经过较短的驯化时间后,固定化颗粒反应器可形成优势菌,改变运行条件或经过长时间搁置后,颗粒中生态群落结构保持稳定;反应器中AOB较单一,以Nitrosomonas sp.为主,但具备一定抗冲击负荷能力,NOB以Nitrobacter sp.为主,全程硝化反应器中具有亚硝化反应器中所不具备的Nitrobacter sp.219、Nitrobacter sp.263。

PCR-DGGE结合传统分离培养分析盒装豆腐腐败菌多样性

研究了盒装豆腐中腐败菌多样性特征及与盒装豆腐的种类、产地的相关性,以期为盒装豆腐的加工贮藏提供理论依据。采用传统培养分离及PCR-DGGE方法对3个产地的盒装内酯豆腐、盒装老豆腐、盒装嫩豆腐中腐败菌多样性进行研究比较。传统培养分离方法观察了豆腐中主要腐败菌的形态及菌落特征,并结合生化试验对腐败菌株进行了鉴定;PCR-DGGE技术提取豆腐中腐败细菌的基因组DNA,扩增细菌16s rDNA V3可变区,PCR产物经DGGE电泳分析,选取优势条带割胶回收,克隆子测序,序列比对及构建菌株系统发育树,同时做样品相似性分析。结果表明:芽孢杆菌为盒装豆腐主要腐败菌,盒装豆腐腐败菌多样性与豆腐产地相关性较高,而与豆腐种类相关性不高。

微生物强化对椒坯发酵群落多样性及性质的影响

描述了应用磷脂脂肪酸(phosphoric acid fatty acids,PLFAs)及聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术研究微生物强化发酵椒坯群落多样性变化的规律。研究表明,高盐发酵使椒坯的细菌生物量显著降低;对于强化的样品,因所使用的菌株及强化方式不同,其群落多样性及优势菌差异显著,假丝酵母菌Candida versatilis强化提高了椒坯总生物量,鲁氏酵母Zygosaacharomyce rouxii则相反;共培养强化提高了椒坯以Tetragenoccus和Zygosaacharomyces为主的优势菌的生物量,同时发现嗜盐四链球菌Tetragenoccus halophilus对Vagococcus具有明显的抑制作用。理化研究表明,不同强化方式使样品的总酸(TA)、还原糖(RS)和氨基态氮(FN)等参数略有差异。不同强化方式对挥发性组分贡献不同,其中,共培养强化使椒坯挥发性组分总含量提高了28.46%。该研究揭示了强化发酵对椒坯微生物群落和品质的影响规律,对微生物强化技术在传统发酵的应用有一定的指导作用。

人颊黏膜微生物群落年龄相关性演替研究

目的初步探讨健康人群颊黏膜菌群组成在不同年龄及牙列阶段的动态演替过程。方法 25例健康受试者根据年龄及牙列情况分为5组:乳牙列组、混合牙列组、青少年组、青年组及老年组;分别提取各样本的细菌总DNA进行聚合酶链式反应,采用Quantity One软件对扩增产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱进行生物信息学分析。结果 1)颊黏膜菌群的组成具有个体差异性。2)乳牙列组、混合牙列组、青少年组、青年组及老年组DGGE指纹图谱的平均条带数分别为21.2±4.0、17.8±3.9、15.8±4.3、16.8±3.7、22.2±6.5,各组间的差异无统计学意义(P>0.05),提示颊黏膜优势菌群的数量在各个年龄阶段保持相对稳定。3)5组的Shannon指数分别为1.73±0.2、1.43±0.1、1.05±0.2、1.45±0.2和1.63±0.3,各组间的差异有统计学意义(P=0.003);提示颊黏膜微生物的多样性在儿童至青少年阶段呈下降趋势,在青年至老年阶段呈上升趋势。4)群落结构相似性聚类分析发现:同组内大部分样本聚类位置相近,群落结构表现出较高的相似性;不同组的大部分样本未聚类在一起,群落结构呈现出一定的差异性。结论不同年龄组健康人群的颊黏膜微生物群落组成存在差异,青少年期可能是颊黏膜微生物多样性改变的重要转折点。

高通量测序技术在传统发酵食品微生物群落中的应用研究

传统发酵食品风味独特,营养丰富,历史悠久,生产方式多采用自然接种,部分食品的生产工艺已有数千年的历史,其最终质量与发酵过程中存在的多种微生物密切相关。研究表明,运用现代分子生物学技术,可从基因水平上揭示微生物的多样性和群落结构的动态变化,系统阐明其发酵机理。该文综述高通量测序技术在传统发酵食品微生物群落中的应用研究,对聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-FQPCR)、宏基因组、宏转录组测序等研究方法的原理、操作方法及其研究成果进行了总结,并对各分析技术优缺点进行了比较,旨在为传统发酵食品的微生物群落研究提供参考。