聚合酶链式反应-限制性内切酶多态法检查川贝母的掺伪情况

目的应用DNA分子鉴定技术检测川贝母的掺伪情况。方法收集111份川贝母及其主要伪品对口药材,应用聚合酶链式反应-限制性内切酶多态法(PCR-RPLF)对川贝母、川贝母伪品及混合样品进行检测。结果该方法能够检出川贝母中伪品的掺伪量,随着掺伪量的增加,未切DNA条带灰度增强而被切条带减弱;未切条带相对于被切条带而言,其灰度比率相应增加;当掺伪量达75%时,几乎观察不到被切条带。结论所用方法灵敏度高,通过测量琼脂糖凝胶电泳图中DNA条带的灰度值强弱,可知道川贝母中大概的掺伪比例,可用于川贝母样品中掺伪量的检测。

老白干酒曲中酵母菌多样性分析

采用微生物分离培养与分子鉴定相结合的方法,在对酒曲中的酵母菌进行分离、纯化和形态学鉴定基础上,进行菌株核糖体26S rDNA聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术结合的分子鉴定。并采用非培养方法,直接提取酒曲中的总DNA进行聚合酶链式反应扩增、电泳和切胶与回收,通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)法鉴定酵母菌。结果表明,采用培养方式分离到57株6种不同形态的酵母菌,经鉴定为5种分子类型,分别为奥默毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、阿氏丝孢酵母(Trichosporon asahii)。经PCR-DGGE法鉴定得到10株酵母菌,分别为W. anomalus、Wickerhamomyces sp.、T. asahii、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和Candida sp.各1株,Hyphopichiaburtonii 2株,另有unculturedSaccharomycopsis3株。培养与非培养两种方式共鉴定得到10株酵母菌,分别属于8个属,包括P. kudriavzevii、C. lusitaniae、W. anomalus、R. mucilaginosa、T. asahii、uncultured Saccharomycopsis、H. burtonii、Wickerhamomyces sp.、C. tropicalis、Candida sp.,该研究结果可为进一步研究酒曲的发酵能力提供参考。

应用PCR-RFLP技术检测短喙矮小综合征鹅细小病毒

为准确诊断鸭短喙矮小综合征(SBDS)以及鉴别鹅细小病毒感染鸭群中新发短喙矮小综合征鹅细小病毒(SBDS-GPV),本研究通过对GenBank登录的水禽细小病毒基因组核苷酸序列的比对分析,根据该病毒5'非编码区基因序列特征设计一对特异性引物,建立了SBDS-GPV聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法。特异性试验和敏感性试验显示,水禽细小病毒特异性引物可以扩增得到约200 bp的目的片段,SBDS-GPV PCR产物能够被SspⅠ酶切为140 bp和60 bp两个片段,番鸭细小病毒与德兹西氏病小鹅瘟病毒则不能被酶切,检出SBDS-GPV DNA的最低浓度为2.28×10~7拷贝/μL。利用该方法对14份疑似SBDS临床样品检测,阳性样本采用SPF鸭胚进行病毒分离,结果显示SBDS-GPV PCR-RFLP检测的阳性样本经病毒分离均为SBDS-GPV。上述研究表明,该SBDS-GPV PCR-RFLP检测方法特异性强、敏感性高,为SBDS的防控提供了有效手段。

牦牛κ-酪蛋白新遗传变异体及进化分析

为明确牦牛乳中κ-酪蛋白中遗传多样性,以κ-酪蛋白基因(CSN3)的IV外显子为研究对象,采用PCR-RFLP方法对麦洼牦牛的CSN3进行分析,旨在从分子水平揭示κ-酪蛋白在牦牛乳中遗传多样性分布.并以CSN3的IV外显子序列建立牛属κ-酪蛋白的系统发育树,从而分析进化关系.结果表明,牦牛乳中κ-酪蛋白多数以纯合体形式存在,并发现了一个新的变异体GU441771.牛属CSN3的系统发育树分析表明,κ-酪蛋白在进化上存在一定的物种特异性.

牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆

根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX 4T 1中,将pGEX 4T 1/bovIFN γ转化到大肠杆菌中DH5α中。

IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株的快速鉴别诊断

【目的】利用限制性酶切位点的特异性,鉴别IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株。【方法】根据IBDVVP2基因的共保守序列设计1对引物,分别以IBDV超强毒株GX8/99、陕西分离株、强毒株(XZ-1、ZZ-1、JL、GX-2、JS-2、SD-1、SD-3、HeN-4、ZJ-1、JX-2、JS-30)和疫苗株(B87、NF8)的VP2保守序列为模板,采用RT-PCR方法扩增VP2基因的共保守序列,并构建IBDV不同毒株的重组质粒。用AhaⅠ/StuⅠ和BamHⅠ/NspⅠ2组限制性内切酶分别对超强毒株、强毒株及疫苗株的重组质粒进行酶切鉴定。【结果】扩增出了IBDVVP2基因中的共保守序列,其长度为802 bp。超强毒株能被AhaⅠ/StuⅠ切出327 bp的片段,而强毒株及疫苗株则能被BamHⅠ/NspⅠ切出270 bp的片段。【结论】此种RT-PCR结合限制性内切酶酶切的鉴别方法能够很好的区分IBDV超强毒株与强毒株和疫苗株。

青海省汉族妊娠期高血压疾病与维生素D受体基因FokⅠ多态性的关系

目的 探讨维生素D受体(VDR)基因单核苷酸多态性(SNP)FokⅠ(rs2228570/rs10735810)位点多态性与青海省汉族妇女妊娠期高血压疾病(HDCP)的相关性。方法 选择青海省汉族HDCP患者137例(HDCP组),正常汉族孕妇146例(对照组),使用聚合酶链式反应-限制性核酸内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测HDCP组和对照组FokⅠ位点的基因分型并测序验证,使用SPSS 19.0统计学软件检验两组一般临床资料、基因型及等位基因频率分布差异是否具有统计学意义。结果 HDCP组和对照组FokⅠ位点FF、Ff、ff基因型频率分别为51.82%、37.96%、10.22%和34.93%、43.15%和21.92%(χ^(2)=11.099,P<0.05),HDCP组FF基因型(OR=2.004,95%CI=1.243~3.231)频率高于对照组;HDCP组和对照组FokⅠ位点F和f等位基因频率分布差异有统计学意义(χ^(2)=12.454,P<0.001),HDCP组F等位基因(OR=1.253,95%CI=1.105~1.421)频率高于对照组。结论 VDR基因FokⅠ位点多态性与青海省汉族HDCP相关,其中F等位基因可能是HDCP的易感基因,FF基因型可能是HDCP的易感基因型。

千里香杂合度PCR-RFLP快速评估方法的建立

目的:建立一种快速评估千里香种质材料杂合度的方法,为制定千里香的优异种质繁育策略和促进种质创新提供依据。方法:以65株千里香重测序数据为基础,检测并筛选单核苷酸多态性(SNPs),利用其中20个SNP位点,通过自编脚本将其转化为限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)标记;采用聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)法对12份千里香种质的20个RFLP标记进行检测,根据RFLP标记位点酶切片段数目计算千里香种质的杂合度;采用plink软件计算12份千里香种质的全基因组杂合度,并比较不同种质杂合度评估方法得到的结果。结果:PCR-RFLP法和基因组重测序法计算的杂合度间差异无统计学意义。利用PCR-RFLP法筛选获得了8份杂合度<30%的种质材料,利用基因组重测序法筛选获得9份杂合度<30%的种质材料,2种方法计算杂合度均<30%的种质材料共7份。结论:该文建立了千里香种质杂合度评估的PCR-RFLP法,其精确度为87.5%,准确率为77.8%,该法可为其他药用植物种质杂合度评估方法研究提供借鉴。

对市场上一种新的松贝伪品的比较研究

目的:比较松贝与新出现伪品的不同特征,为鉴别检验提供依据。方法:综合性状、聚合酶链式反应-限制性内切酶多样性(PCR-RFLP)法、DNA序列比对、系统进化树以及遗传距离等方法,寻找松贝与新伪品的鉴别要点。结果:该贝母在性状上与松贝正品还是存在一定差异。按照《中华人民共和国药典》2015年版PCR-RFLP法检验,松贝PCR产物可以被完全酶切,而该伪品的PCR产物只能部分被酶切;测序分析可知,其部分酶切的原因是SmaⅠ酶切位点“CCCGGG”中第2位为C/T多态性位点。在内部转录间隔区(ITS区)266 bp范围内,该伪品与松贝比较有8个突变位点。系统进化树分析,该伪品与川贝母6个基原物种没有聚为一支。遗传距离分析,该伪品与川贝母6个基原物种的距离明显大于6个基原物种之间的距离。结论:该贝母的基原植物与松贝不同,应与松贝严格区分,以维护消费者经济利益,并为安全用药提供保障。