猪萨佩罗病毒聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)是引发猪腹泻的重要病毒之一。为开发一种能快速、准确检测PSV的聚合酶链式反应检测方法,针对PSV的保守区3D基因设计了一对特异性引物,优化了聚合酶链式反应退火温度,分析聚合酶链式反应检测方法特异性和灵敏度,并应用于猪场样品检测。结果表明:建立的聚合酶链式反应检测方法可特异性扩增出PSV目的片段,对其他非靶标猪腹泻病毒则无条带产生,检测低限为5拷贝/μL;在浙江地区采集的88个健康猪粪便样本中检测PSV阳性率为7.95%。该PSV聚合酶链式反应检测方法特异性强、灵敏度高,可应用于PSV前期诊断和防控。

聚合酶链式反应检查法、细菌培养法在阴道细菌检查中的应用价值

目的:探究聚合酶链式反应(PCR)检查法、细菌检查法在阴道细菌检查中的应用价值。方法:选择2022年1—12月进行阴道细菌检查的阴道炎患者作为研究对象,共45例。收集所有患者的阴道分泌物,行PCR检查和细菌培养法检查,分析检验结果。结果:PCR检查法阳性检出率高于细菌培养法、肠球菌、棒状杆菌、加特纳菌、检出率高于细菌培养法(P<0.05)。结论:在阴道细菌检查中,PCR检查法相对于细菌培养法具有更高的应用价值,其病原菌检出率更高,为细菌性阴道炎的准确诊断和个体化治疗提供了更可靠的手段。

TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌

目的建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×10^(2) cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(r^(2))均大于0.999。结论本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30 min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。

基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒

神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT-PCR产物421bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%。将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelusspp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上。对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒。结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原。RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法。

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

PCR(聚合酶链式反应)仪温度特性的实验研究与分析

该文的目的是测量PCR温度的精确性和PCR仪上孔间以及不同循环和不同次测量的温度均一性。PCR程序:95℃(变性),30 s;55℃(退火),40 s;72℃(延伸),50 s;6个循环。孔和管内的温度重复性都很好;变性阶段,孔和管内液体温度与程序温度偏差较大,孔及管内的温度均一性和重复性均很好;孔内温度不能达到通常所需的温度(90℃以上)的比例为22.2%。退火和延伸阶段孔和管内的温差较小;有2个孔不能达到通常需要的温度。实际温度在各阶段停留的时间分别占设定时间的90%的比例较低。这些缺陷可能导致扩增结果假阳性或假阴性。

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)基因组全序列,选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4,并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3,用引物P1/P4进行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4进行复合套式PCR,建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段,与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT-nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明,有15份类似CDV强毒,5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT-nPCR可以有效检测CDV感染,能够将强、弱毒株区分开,可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。

应用聚合酶链式反应(PCR)技术检测野猪的氟烷基因

猪应激综合征(ProcineStressSyndrome,PSS)是指猪在应激因子的作用下发生恶性高热综合症(MalignantHyper thermiaSyndrome, MHS)。试验随机选取18头纯种野猪提取基因组DNA进行聚合酶链式反应,扩增得到RYR1 基因特异片段,经过HhaⅠ酶切阳性鉴定可断定这18头猪的RYR1 基因都没有发生突变,因此不存在猪应激综合征问题。

实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测4种食源性致病弧菌

目的建立和优化4种食源性致病弧菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)快速检测方法。方法基于副溶血性弧菌的toxR基因(GenBank ID:MH047287.1)、霍乱弧菌的ompW基因(GenBank ID:MF100046.1)、拟态弧菌的toxR基因(GenBank ID:EF693743)和创伤弧菌的vvhA基因(GenBank ID:KC821520.1)设计常规PCR引物和qPCR特异性引物和探针。分别建立副溶血性弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌4种食源性致病弧菌的单重qPCR检测体系,根据扩增曲线和Ct值对探针浓度进行优化,设置探针浓度梯度。结果4种弧菌的探针最适浓度均为0.1µmol/L。对设计的4种弧菌的引物分别进行常规PCR的扩增,其最低检出限均为1×10^(5) copies/µL,4种弧菌分别进行单重qPCR的最低检出限均为1×10^(1) copies/µL,扩增效率均接近100%。qPCR的灵敏度均高于常规PCR。特异性实验结果表明,4种目的弧菌DNA扩增出特异性曲线,其他的非目的基因未被扩增出扩增曲线。结论该方法准确度和灵敏度高,前处理简单快速,适用于4种食源性致病弧菌的荧光定量PCR快速检测。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

聚合酶链式反应(PCR)量热学的实验研究

聚合酶链式反应(PCR)是一种人工体外扩增特异DNA片段的技术。PCR反应的三个过程都是热过程。本文首次利用差式扫描量热仪(DSC)模拟PCR反应。试验表明PCR反应变性过程是吸热过程;退火和延伸过程是放热过程;并且获得了这些过程的量热学数据。这些研究结果对分析和判断PCR临床检验的假阴性是有用的。

应用聚合酶链式反应(PCR)技术诊断仔猪水肿病

聚合酶链式反应(PCR)是一种DNA快速扩增技术及基因检测的常用手段。应用PCR技术原理,研究建立了仔猪水肿病PCR检测方法。试验结果表明:该方法的敏感性测定模板浓度为4.5 pg,特异性测定仔猪水肿溶血性大肠杆菌在230 bp出现特异扩增带。通过对24份疑似仔猪水肿病样本的检测,测得仔猪水肿病的阳性率为75%(18/24);用血清型鉴定试验检测,检出率为54.17%(13/24);两种试验对比检测的符合率为72.22%(13/18)。表明:仔猪水肿病PCR检测方法具有敏感性强、特异性高、检测快速等优点,为仔猪水肿病临床诊断提供了快速检测参考依据。

聚合酶链式反应(PCR)用于检测环境水体指示菌的研究

对聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ） 快速检测水体指示菌———大肠菌群（ｔｏｔａｌ ｃｏｌｉｆｏｒｍ） 和大肠杆菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） 进行了研究．采用的两对引物分别扩增了ＬａｃＺ基因的约２６０ｂｐ 和ＵｄｉＡ 基因的约１５０ｂｐ ＤＮＡ 片段．引物Ⅰ和引物Ⅱ最低能分别扩增１０ － ６μｇ 或１０ －８ μｇ 基因组ＤＮＡ．整个检测工作在采集水样后５ —６ｈ 内完成．与常规水质检测法相比，ＰＣＲ 法具有快速，准确的特点。

常用聚合酶链式反应(PCR)技术概述

聚合酶链式反应（PCR）技术在过去20多年中，经过不断改良以及与其他研究手段相结合，如今已发展为有数十种之多研究方法的一套技术手段。本文对较常用的几种PCR技术手段的原理、优点、缺点和应用等作了概述。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测罗氏沼虾诺达病毒

用逆转录聚合酶链式反应方法,检测5尾来自广西某罗氏沼虾养殖场典型白肉病症状罗氏沼虾肌肉中的诺达病毒,结果是阳性5尾,占100%。该检测方法耗时短,特异性、实用性强,灵敏度高。

聚合酶链式反应(PCR)用于蚊虫分类鉴定的研究概况

在蚊虫分类中,长期以来都是以形态特征作为分类的依据,然而世界上重要的媒介蚊虫几乎都属于由几个甚至十几个近缘种组成的复合体,它们虽然外部形态相似,但其生态习性、分布区域和媒介效能等却可能有很大差异,所以对其进行正确鉴别具有重要的流行病学意义。然而许多复合体的相继发现,亲缘种的存在,使得单纯的形态分类学无法对其进行正确鉴别。虽然有些学者已经应用遗传杂交、同工酶、多线染色体及气相层析分析昆虫体表碳水化合物组分等方法对近缘种进行了分类研究,但都难以对亲缘种做出可靠鉴定或在流行病学调查中推广应用。 近30年来分子生物学技术迅速发展,显示其在蚊类鉴别应用中的极大潜力,为蚊虫分类学研究提供了许多新思路新方法。其中PCR技术由于原理简单,方法简便,敏感性高,标本材料极省,蚊类虫期、性别不限等优点,被广泛应用于蚊虫近缘种的分类鉴定中。Paskewitz等首先应用PCR技术,对冈比亚按蚊（An.gambiae）和阿拉伯按蚊（An.arbiebsis）进行分类鉴定。Porter和Collins对佛氏按蚊（An.freeborni）和赫氏按蚊（An hermsi）的rD-NA/ITS2区使用PCR法作蚊种鉴别,其他一些国内外学者在此方面也进行了一些研究,本文就该领域的研究现状及PCR技术应用于蚊虫分类的特点进行简要的概述。

聚合酶链式反应(PCR)技术在植物病害诊断中的应用

PCR技术是一项崭新的体外扩增基因的技术 ,已广泛应用于与生命相关的学科的研究。本文从植物病害检测的角度 ,探讨如何应用PCR技术来进行植物病害的检测。

聚合酶链式反应(PCR)荧光检测研究

本文研究了荧光能量传递技术 (fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET) ,建立了一套基于该理论在聚合酶链式反应 (PCR)中用于荧光检测和溯源性研究的实验装置 。