“天仙丸”对DNA聚合酶a及DNA模板活性的影响

<正> “天仙丸”(又名复方天仙胶囊)是抗恶性肿瘤新药,经临床验证有明显抗癌作用,尤其对消化道肿瘤效果更佳;同时实验证明对小鼠移植性实体瘤S—180,艾氏腹水癌等均有明显的抑制作用。为进一步探讨“天仙丸”抑瘤的分子生物学基础,观察了该药在体外对DNA聚合酶a及DNA模板活性的影响。材料与方法 1.主要试剂和仪器 ~3H—TTP(放射比强度25居里/毫克分子,英国放化中心产品);dATP,dGTP,dCTP均为美国Sigma公司产品;

血清中DNA聚合酶α在阿尔茨海默病中的表达和诊断价值分析

目的探究血清中DNA聚合酶α(DNA polα)在阿尔茨海默病(AD)中的表达水平,分析其在AD中的诊断价值。方法选取2019年3月至2023年4月在首都医科大学宣武医院就诊的AD痴呆(DAT)期患者100例作为DAT组,轻度认知障碍(MCI)期患者43例作为MCI组;同期,选取68例同年龄组别的健康者作为HC组。检测各组血清样本中DNA polα的表达水平,利用受试者工作特征(ROC)曲线分析DNA polα在AD中的诊断价值。结果DAT组血清DNA polα表达水平高于MCI组(P<0.05)和HC组(P<0.001),随着AD病程发展,DNA polα表达水平有递增趋势。DNA polα表达水平与简易智能精神状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分均呈负相关(r=-0.1553、-0.2037,P<0.05)。DNA polα诊断DAT期的曲线下面积(AUC)为0.682,灵敏度为0.900,特异度为0.412;DNA polα诊断MCI期的AUC为0.546,灵敏度为0.977,特异度为0.250;DNA polα鉴别诊断MCI期和DAT期的AUC为0.664,灵敏度为0.780,特异度为0.535。结论DNA polα在DAT期AD患者中表达水平升高,且其表达水平与AD病程发展存在一定联系,推测DNA polα有可能是诊断AD潜在的血液生物标志物。

Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

polo样激酶1、RNA聚合酶Ⅱ亚基A在人脑胶质瘤中的表达及与预后的关系

目的 探讨polo样激酶1(PLK1)、RNA聚合酶Ⅱ亚基A(POLR2A)在人脑胶质瘤(BG)中的表达及与预后的关系。方法 选取86例BG患者作为观察组,另选取30例非肿瘤脑疾病患者作为参照组,收集观察组患者的BG组织和参照组患者的非肿瘤脑组织。比较两组患者PLK1、POLR2A表达情况和不同临床特征BG患者的BG组织中PLK1、POLR2A的阳性表达情况;比较不同PLK1、POLR2A表达情况BG患者的生存情况;采用Cox回归模型分析BG患者预后的影响因素。结果 观察组患者PLK1、POLR2A阳性表达率分别高于参照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。低分化BG患者的BG组织中PLK1、POLR2A阳性表达率均高于中高分化患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。PLK1、POLR2A阳性表达患者的中位生存时间均明显短于PLK1、POLR2A阴性表达患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。Cox多因素回归分析结果显示,低分化、PLK1阳性表达、POLR2A阳性表达均为BG患者预后的独立危险因素(P﹤0.05)。结论 BG患者PLK1、POLR2A呈高表达,PLK1、POLR2A高表达BG患者中位生存时间缩短,低分化、PLK1阳性表达、POLR2A阳性表达均为BG患者预后的独立危险因素。

DNA聚合酶θ:易错的多功能DNA末端修复分子

DNA聚合酶θ(DNA polymerase theta,Polθ)是一种广泛存在于动植物中的DNA修复酶。它在选择性末端连接(alternative end-joining,Alt-EJ)途径中发挥着关键作用,常参与DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)损伤修复。在正常生理状态下,Polθ主要调控基因组稳定性。然而,在恶性肿瘤发生时,Polθ表现出异常高表达水平,并参与调控肿瘤细胞的恶性转变过程。研究表明,抑制Polθ活性可导致同源重组(homologous recombination,HR)缺陷的肿瘤细胞发生合成致死(synthetic lethality,SL)。因此,已经开发出多种针对Polθ的小分子抑制剂,可与其他化疗药物联合使用以抑制恶性肿瘤的发展。此外,敲除或抑制Polθ活性还能增加HR修复效率,从而提高外源基因靶向整合效果。本文综述了Polθ及其介导的Alt-EJ修复机制在生物学功能方面的最新研究进展,为靶向Polθ在肿瘤治疗和基因编辑方面的应用提供理论基础。

基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

基于重组酶聚合酶扩增技术的牛源性成分快速检测方法

市场中肉类食品掺假的复杂多样化使得监管机构对动物源性成分鉴定的便捷性、准确性、灵敏性要求越来越高。尤其是市场上经济价值较高的牛肉类产品已成为制假的重灾区,迫切需要建立一种快速、高效的牛源性成分分子检测方法。基于此,以牛组成型表达基因β-actin为靶基因设计并筛选了几组牛特异性扩增的引物和探针组合,经过灵敏度检测和特异性验证,建立了一种牛源性成分实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)快速检测方法。通过优化试剂配比,提高了一步法提取牛肉制品DNA的效率,同时将PRA技术与胶体金免疫试纸条显色技术相结合实现了检测的便捷化和结果的可视化。实际应用结果表明,研究建立的牛源性RPA检测方法能够特异性地检测牛源性成分,且最低检测灵敏度可达到14.8个拷贝,通过胶体金免疫试纸条得到的可视化结果的准确性和灵敏度与实时荧光RPA相同。该方法特异性强、灵敏度高,整个过程在25 min内即可完成,极大缩短了检测时间。

重要人感染RNA病毒复制机制和靶向聚合酶药物开发研究进展

近年来,拉沙热、埃博拉、新冠和尼帕等多种病毒性传染病在世界范围内频繁暴发,给人类健康和社会经济发展带来了巨大威胁。广谱抗病毒药物是主动应对新发突发病毒性传染病的重要手段之一,而其研发的关键是发现病毒特有的保守药物靶点。病毒聚合酶负责病毒基因组的复制和转录过程,蛋白序列相对保守,是理想的药物靶点。本文以重要人感染RNA病毒聚合酶的工作机制和靶向病毒聚合酶的药物开发展开综述,为未来新发突发传染性疾病防控提供新思路和新策略。

TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌

目的建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×10^(2) cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(r^(2))均大于0.999。结论本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30 min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。

多聚ADP-核糖聚合酶-1在放射性认知功能障碍中的研究进展

放射治疗后多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)的过度激活与神经炎症反应密切相关,而神经炎症是放射性认知功能障碍(RICD)的主要发病机制。该文分析了RICD中神经炎症反应的病理生理机制,包括小胶质细胞激活、星形胶质细胞的增生、少突胶质细胞的破坏、海马微环境改变和血脑屏障损伤,并对PARP-1通过这些共同机制介导神经炎症反应进而加重RICD的研究进展进行综述。最后,探讨了PARP-1抑制剂对RICD的潜在保护作用,旨在为RICD防治药物的开发提供新方向。

细粒棘球绦虫DNA损伤修复聚合酶ζ生物信息学分析及初步验证

目的对细粒棘球绦虫DNA损伤修复聚合酶ζ(DNA damage repair polymeraseζof Echinococcus granulosus sensu lato,EgPolζ)进行生物信息学分析,并分析去氢骆驼蓬碱(Harmine,HM)及其衍生物H-2-168、H-2-104干预后对EgPolζ的影响。方法提取细粒棘球绦虫总RNA并逆转录合成cDNA,利用RT-PCR技术克隆EgPolζ,通过测序获得EgPolζ全长序列。采用生物信息学在线网站、在线数据库与分析软件等工具预测和分析EgPolζ相关生物学信息,构建系统进化树进行同源性比较,HM及其衍生物H-2-168和H-2-104与EgPolζ蛋白进行分子对接。Western Blot检测HM及其衍生物H-2-168和H-2-104干预细粒棘球绦虫后EgPolζ含量变化。结果经生物信息学预测分析EgPolζ为亲水性蛋白,缺乏信号肽位点,但具有一个跨膜区域;该蛋白具有多个酸磷酸化位点;其结构域包含DNA聚合酶δ催化亚单位、3'-5'核酸外切酶结构域超家族与DNA聚合酶B型家族催化域;EgPolζ二级结构中与抗原表位相关的β-折叠约占4.59%;分析EgPolζB细胞抗原表位且对其进行评估后得到8条预测表位;EgPolζ与多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)的Polζ序列相似性为93.56%,二者同属于绦虫纲,进化关系较近,与智人和家鼠等哺乳动物的进化关系较远。HM、H-2-168和H-2-104与EgPolζ蛋白结合能分别为-5.91、-5.71与-5.05 kcal/mol;Western Blot结果分析:与DMSO组相比,HM组与H-2-104组EgREV3蛋白含量均降低(P<0.05,P<0.01);H-2-168组中EgREV3蛋白含量无显著变化(P>0.05)。结论成功克隆了EgPolζ全长序列,分析预测EgPolζ对细粒棘球绦虫的DNA修复具有调控作用,且HM与H-2-104抑制EgPolζ蛋白表达,从而影响细粒棘球绦虫DNA损伤修复功能。

重组酶聚合酶扩增技术在动物病原菌检测中的应用进展

体外核酸扩增技术在动物疫病病原检测中应用广泛。重组酶聚合酶扩增(RPA)作为一种新型的核酸等温扩增技术,可在较低温度(37~42℃)下扩增DNA或RNA,具有反应时间短、样品制备量少、特异性和敏感性高等优点。RPA突破了常规聚合酶链反应(PCR)实施时对实验室条件的依赖性,并能高效和灵敏地检测动物疫病病原。基于RPA技术的病原菌检测方法可实现对动物细菌病的现场快速诊断。论文综述了RPA技术的反应体系和条件、反应原理和产物检测方法等,介绍了RPA技术在动物病原菌检测中的应用和潜在价值,以期为动物疾病快速诊断研究提供参考。

新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂研究进展

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型导致的新型冠状病毒感染席卷全球,寻找广谱抗病毒特效药一直是一项重大任务。RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶是一类不同病毒间在结构和功能上高度保守的关键非结构蛋白,针对该聚合酶为靶点开发新的小分子抑制剂至关重要。本文作者从新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结构为出发点,详细阐述了该病毒RNA依赖性RNA聚合酶的作用机制以及不同种类抑制剂的特点。着重从药物化学的角度介绍了核苷类似物和非核苷类似物的作用特点和作用机制,综述了多种小分子聚合酶抑制剂化学结构与生物活性之间的关系。

三结构域蛋白8、Ras相关蛋白35、多聚ADP核糖聚合酶1在子宫内膜癌组织中的表达及检测临床意义

目的:探讨三结构域蛋白8(TRIM8)、Ras相关蛋白35(Rab35)、多聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1)在子宫内膜癌(EC)组织中的表达及检测临床意义。方法:选择75例EC患者为研究对象,取手术切除的EC组织及癌旁正常子宫内膜组织,以免疫组织化学法检测EC组织和癌旁组织中TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表达情况,并结合患者临床病理因素分析其与临床病理特征的关系,随访5年,记录EC患者生存率,并分析EC患者预后影响因素。结果:Rab35、PARP-1蛋白在EC组织和癌旁组织中阳性表达率分别为71.00%和35.00%、74.00%和43.00%,TRIM8蛋白阳性表达率分别为30.00%和69.00%(均P<0.01)。EC组织中Rab35与PARP-1为正相关性,Rab35和PARP-1与TRIM8表达为负相关性(r=0.542、-0.461、-0.461,均P<0.05)。Rab35阳性患者5年生存率55.17%低于阴性患者70.57%,PARP-1阳性患者5年生存率65.96%低于阴性患者79.24%,TRIM8阳性患者5年生存率93.33%高于阴性患者72.73%(均P<0.05)。FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、肌层浸润深度≥1/2和PARP-1、TRIM8、Rab35表达异常为影响EC患者预后的危险因素(均P<0.05)。结论:子宫内膜癌组织PARP-1、Rab35表达升高、TRIM8表达降低,三者表达变化与子宫内膜癌的发生、发展有显著相关性。

聚合酶链反应方法检测阴道毛滴虫准确性的meta分析

目的系统评价聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的应用价值。方法检索中国知网数据库(CNKI)、万方数据知识服务平台、维普数据库和PubMed数据库自建库到2023年5月30日以来基于PCR方法检测阴道毛滴虫的研究文献。经文献筛选、数据提取后,使用软件RevMan 5.4.1和网页服务Meta-Disc 2.0进行Meta分析。结果共纳入36篇文献,16454个临床样本。Meta分析结果显示:聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的合并敏感度为0.972(0.943,0.987),合并特异度为0.979(0.968,0.986),诊断比值比为1643.398(673.168,4012.008),阳性似然比为46.209(30.549,69.897)和阴性似然比为0.028(0.013,0.059);亚组分析表明不同性别的临床样本不会影响聚合酶链反应的检测准确性,但不同的PCR检测方法的准确性有差异。结论聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的准确性较高,具有良好的应用价值。

重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。

疏肝健脾补髓方防治多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂维持治疗卵巢癌所致血液毒性的效果观察

目的观察疏肝健脾补髓方防治多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂(PARPi)维持治疗卵巢癌所致血液毒性的效果。方法选取2021年8月至2023年12月就诊于安徽医科大学第一附属医院中西医结合肿瘤科及医联体科室符合纳入标准的卵巢癌患者60例,按照随机数字表法分为观察组(30例)及对照组(30例)。对照组予以PARPi维持治疗,观察组在对照组基础上联合疏肝健脾补髓方同步治疗。治疗3个月后比较2组血液毒性发生率、严重程度、持续时间、中医证候积分及疗效、不良反应情况。结果治疗3个月后,观察组贫血、血小板减少及中性粒细胞减少发生率[26.7%(8/30)比53.3%(16/30)、23.3%(7/30)比50.0%(15/30)、20.0%(6/30)比46.7%(14/30)]及严重程度均低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。观察组贫血及血小板减少的持续时间均短于对照组[(2.56±1.33)d比(4.21±2.00)d、(7.33±0.38)d比(9.26±1.22)d],差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗3个月后,观察组中医证候积分明显低于对照组,中医证候疗效好于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。观察组恶心呕吐、腹泻、便秘发生情况轻于对照组(均P<0.05)。结论疏肝健脾补髓方可减轻血液毒性发生率及严重程度,缩短发生时间,同时改善患者中医证候疗效,安全性尚可,维护了PARPi治疗的应答持续性。

流感病毒RNA碱性聚合酶-2抑制剂研究进展

季节流行性感冒是一种易在人际传播的急性病毒感染,是目前对人类健康构成威胁的主要呼吸道传染病之一。迄今为止,流感的预防和治疗主要采用接种疫苗预防和开发抗病毒药物防治并重的应对手段。目前临床应用的抗流感病毒药物包括基质蛋白-2抑制剂(如金刚烷胺)、神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦)、内切酶抑制剂(如巴洛沙韦酯)和聚合酶抑制剂(如法匹拉韦)等,均已产生广泛耐药性。研究开发机制新颖的、与现有药物没有交叉耐药的抗流感病毒药物是解决季节流行性感冒治疗这一尚未完全解决的医学问题,以及应对流感大规模爆发的有效手段。流感病毒RNA碱性聚合酶-2(PB2),由于其在不同流感病毒间的高度保守性而不易产生耐药性,使其成为一个非常有吸引力的药物靶点。目前PB2抑制剂的研究开发已成为抗流感病毒药物的一个热点,特别是围绕明星分子吡莫地韦及其类似物的研究吸引了极大的关注,虽然吡莫地韦因疗效不理想最终止步于Ⅲ期临床试验,但是在其研究过程中所揭示出的PB2蛋白与小分子结合模式及构效关系,为进一步开发该类药物奠定了扎实的基础。本文主要针对PB2抑制剂近10年相关药物化学的研究进展进行综述,并对该药物研究领域的前景提出展望。