聚肌胞对CCl_4诱导肝损伤小鼠模型肝内自然杀伤细胞的调节作用

目的观察聚肌胞(Poly I∶C)调节肝脏自然杀伤(NK)细胞活性抗CCl_4诱导肝损伤的作用机制。方法 80只C57BL/6小鼠按体质量分层随机分为正常对照组、Poly I∶C对照组、模型对照组和Poly I∶C组。模型对照组和Poly I∶C组予腹腔注射10%CCl_4(2 ml·kg^(-1)·2 d^(-1))诱导肝损伤模型,正常对照组与Poly I∶C对照组予腹腔注射等剂量橄榄油。Poly I∶C对照组和Poly I∶C组均予Poly I∶C腹腔注射(1 mg·kg^(-1)·2 d^(-1)),正常对照组与模型对照组均予腹腔注射等体积生理盐水。连续用药4周后,观察血清肝功能及肝组织炎症因子水平;HE染色观察肝组织炎症情况;流式细胞术检测肝脏NK细胞及细胞表面激活型受体NKG2D、抑制型受体Ly49A表达。计量资料组间比较采用方差分析,方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett T3法。结果 Poly I∶C给药1周和4周,正常小鼠肝组织均无明显肝损伤。随CCl_4染毒加重,与正常对照组相比,模型对照组血清ALT、AST和TBil水平逐渐升高(P<0.01),肝内促炎因子水平上调(P<0.05),HE染色提示肝细胞大量坏死,肝脏NK细胞比例及NKG2D表达减少、Ly49A表达增多(P<0.05)。Poly I∶C可改善肝损伤小鼠血清肝功能,降低肝内促炎因子,明显改善肝组织炎症,增加肝脏NK细胞比例、数量及其细胞表面激活型受体NKG2D受体表达(P<0.01)。结论 Poly I∶C具有良好的抗急、慢性肝损伤作用,其抗肝损伤的作用机制与对NK细胞的激活密切相关。

补体调节蛋白CD46在聚肌胞苷酸加重三氯乙烯致敏小鼠肝损伤中的表达规律

[目的]研究补体调节蛋白CD46在聚肌胞苷酸(poly I∶C)加重三氯乙烯(TCE)致敏小鼠免疫性肝损伤中的表达和转录水平。[方法]6~8周的雌性BALB/c小鼠36只,随机分为空白对照组(4只),溶剂对照组(4只),TCE组(15只),TCE+poly I∶C组(13只),适应性喂养1周,于第1、4、7、10天作致敏处理,第17、19天作激发处理,TCE+poly I∶C组于末次激发前3 h腹腔注射100μL含50μg poly I∶C的液体。末次激发24 h后进行皮肤评分,48 h后取小鼠血清及肝脏,试剂盒检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST),HE染色法观察小鼠肝脏病理,免疫组化法检测小鼠肝脏CD46和C3片段的表达,RT-PCR法检测肝脏CD46 m RNA表达水平。[结果]空白对照组与溶剂对照组小鼠背部皮肤无水肿与红斑,TCE处理组致敏率33.3%(5/15),TCE+poly I∶C处理组致敏率38.5%(5/13),差异无统计学意义。与溶剂对照组比较,TCE致敏组和TCE+poly I∶C致敏组肝脏系数升高,差异有统计学意义(P<0.01)。血清ALT和AST值在空白对照组、溶剂对照组以及未致敏组之间的差异均无统计学意义;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE+poly I∶C致敏组ALT和AST值升高,TCE+poly I∶C致敏组ALT和AST值相对TCE致敏组升高,差异有统计学意义(P<0.01)。肝脏病理检测发现TCE致敏组小鼠细胞形态异常,部分区域出现细胞水肿,而TCE+poly I∶C致敏小鼠肝脏出现大面积的细胞空泡样变性,肝细胞浆疏松且伊红染色变浅。小鼠肝脏免疫组化显示TCE致敏组C3片段少量沉积,TCE+poly I∶C组C3片段大量沉积,空白对照组、溶剂对照组与未致敏组则未发现。小鼠肝脏免疫组化显示CD46在肝脏细胞膜部位表达,空白对照组、溶剂对照组以及未致敏组高表达,TCE致敏组表达减少,而TCE+poly I∶C致敏组CD46表达极少。肝脏CD46转录水平在空白对照组、溶剂对照组以及未致敏组之间差异均无统计学意义;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE+poly I∶C致敏组CD46转录水平下降,TCE+poly I∶C致敏组CD46的转录水平较TCE致敏组下降,差异有统计学意义(P<0.01)。[结论]CD46可能在poly I∶C加重TCE致敏小鼠免疫性肝损伤中发挥重要作用。

聚肌胞苷酸对肺癌细胞A549生长和功能影响

探讨聚肌胞苷酸(polyI∶C)对肺腺癌细胞(A549)增殖、周期、凋亡及γδT细胞对其杀伤活性的影响。用MTT法检测经polyI∶C处理后的γδT细胞和A549的生长抑制率;流式细胞仪检测经polyI∶C处理后A549 TLR3变化及对细胞周期和凋亡的影响;用乳酸脱氢酶释放法测定γδT细胞对经polyI∶C诱导后的A549杀伤活性。肺癌细胞株A549经25μmol/L polyI∶C诱导24 h后细胞凋亡率为(39.44%±4.11%),明显高于对照组凋亡率(28.72%±1.41%)(P<0.05);细胞周期有一定的改变;肿瘤细胞上TLR3表达没有明显变化。A549在25μmol/L PolyI∶C处理后,其与γδT细胞在效靶比为1∶80时杀伤活性明显高于对照组。polyI∶C能抑制A549细胞生长,增加γδT细胞对诱导后的A549细胞杀伤敏感性。

Poly Ⅰ:C刺激对裸鼹鼠和小鼠巨噬细胞PKR/eIF2α信号通路影响的比较研究

目的比较研究聚肌胞苷酸(Poly Ⅰ:C)对裸鼹鼠和小鼠巨噬细胞双链RNA依赖性蛋白激酶R(PKR)/真核细胞翻译起始因子2α(EIF2α)信号通路的影响。方法分别提取裸鼹鼠和C57BL/6J小鼠巨噬细胞,随机分成对照组、Poly Ⅰ:C给药组、2-氨基嘌呤(2-AP)给药组、Poly Ⅰ:C+2-AP给药组。给药后,蛋白印迹检测细胞中磷酸化PKR(Pho-PKR)、PKR、磷酸化EIF2α(Pho-EIF2α)、EIF2α、Caspase-8蛋白的表达情况。结果 Poly Ⅰ:C给药后,小鼠巨噬细胞的PKR和e IF2α磷酸化水平显著降低(P<0.01),而裸鼹鼠相反则显著升高(P<0.01),表明Poly Ⅰ:C能抑制小鼠的PKR活性,而裸鼹鼠的PKR活性被显著激活;Poly Ⅰ:C干预的基础上通过2-AP抑制PKR活性,结果显示,2-AP给药后下调了小鼠和裸鼹鼠PKR和磷酸化PKR的表达(P<0.01),尤其是裸鼹鼠的PKR,2-AP给药后显著地抑制裸鼹鼠PKR的表达;单独2-AP给药后小鼠巨噬细胞的活性PKR和活性eIF2α比例显著下降(P<0.01),裸鼹鼠巨噬细胞的活性PKR比例也显著下降(P<0.01);通过2-AP抑制PKR活性后,裸鼹鼠细胞的Caspase-8蛋白表达水平显著下降,但小鼠细胞的表达却无显著差异。结论与小鼠比较,裸鼹鼠细胞对Poly Ⅰ:C刺激具有较高的抗性;细胞的PKR对2-AP的敏感性更强;PKR活性对Caspase-8表达有促进作用。

尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因(ifi44)在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]刺激过程中的表达模式,为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框(ORF),通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况,并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后的时序表达情况。【结果】On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp,编码478个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为52.7 kD,理论等电点(pI)为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域(1~157 aa)和1个GTP-bd结构域(197~322 aa),不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%;基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支,二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达,且主要在T细胞亚群表达;经无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后,On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化,且存在明显的时间依赖性。【结论】On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域,进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能;On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后呈时间依赖性上调表达,表明ifi44基因作为重要的调节因子,参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。