叶酸聚谷氨酸合成酶基因rs10760502G>A多态性与儿童急性B淋巴细胞白血病预后及甲氨蝶呤毒副反应的相关性分析

本研究旨在探讨叶酸聚谷氨酸合成酶(FPGS)基因中rs10760502G>A多态性与儿童急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)预后及甲氨蝶呤(MTX)毒副反应的相关性。采用Sequenom MassARRAY时间飞行质谱系统检测rs10760502基因型。实验数据采用x2检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox回归分析等统计方法处理。结果表明:A等位基因携带者(GA+AA)无复发生存率(RFS,log-rank:P=0.004)及无事件生存率(EFS,log-rank:P=0.022)显著低于GG等位基因型携带者。多因素Cox回归分析显示,A等位基因是RFS[hazard ratio(HR),20.173;95%CI,2.535-160.545;P=0.005]及EFS(HR,8.133;95%CI,1.718-38.512;P=0.008)的独立不良预后因素。rs10760502多态与MTX毒副反应间未见相关性。结论:FPGS rs10760502G>A多态性位点可能作为BALL患儿的独立预后因素。

Bacillus methylotrophicus γ-聚谷氨酸合成酶基因的克隆表达

研究了一株非谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)产生菌Bacillus methylotrophicus SK19.001合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达。以p ET-28a(+)载体构建含有pgs BCA合成酶基因的表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21构建重组菌。结果表明,在分别以葡萄糖和谷氨酸为底物的培养基中,重组工程菌都具有合成γ-PGA的能力,说明pgs BCA合成酶基因对于B.methylotrophicus SK19.001产γ-PGA是必需的。pgs BCA合成酶基因序列比对的结果的表明,pgs B和pgs C基因编码的氨基酸序列相对保守。

过表达叶酰聚谷氨酸合成酶对低氮胁迫下叶酸突变体的影响

为了解低氮胁迫下质体定位的叶酰聚谷氨酸合成酶（DFB）对同工酶（DFC）功能缺失作用,通过在拟南芥dfc突变体中过表达DFB,分析低氮条件下过表达DFB拟南芥的主根长度、相关基因转录水平及叶酸含量的变化。结果显示：在低氮环境和dfc背景下,过表达DFB的拟南芥主根长恢复至野生型拟南芥的65%～131%,叶酸和氮代谢相关基因的RT-PCR电泳条带亮度与野生型拟南芥相似,5-甲酰四氢叶酸含量增加至野生型拟南芥的90%～116%。表明,在低氮胁迫条件下DFB在一定程度上能对DFC的缺失起到弥补作用。

桑树叶酰聚谷氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

对桑树叶酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase,FPGS)基因进行克隆,获得2个桑树FPGS基因(分别命名为MaFPGS1和MaFPGS2),其编码区分别编码543、558个氨基酸,推导蛋白质分子质量分别为60.3和61.8 kD,pI值分别为5.73和6.02。MaFPGS1与MaFPGS2的氨基酸序列相似度约为49.80%,MaFPGS1与川桑同源蛋白FPGS(XP_010108389.1)的序列相似度为97.60%,MaFPGS2与川桑同源蛋白FPGSiX4(XP_024025432.1)的序列相似度为91.79%。MaFPGS1和MaFPGS2各自聚在1个分支,二者与枣(Ziziphus jujuba)的FPGS亲缘关系都最近。MaFPGS1和MaFPGS2在桑树嫩叶中的表达量最高,根中表达量最低。在桑树种子萌发过程中,MaFPGS1的表达量比MaFPGS2更高,且在吸水后10 d子叶完全展开时达到最高。在桑树离体再生根系中,MaFPGS2的表达量比MaFPGS2更高,且在诱导7 d后表达就明显上调,而MaFPGS1的表达在诱导15 d后才显著上调,推测MaFPGS可能参与根系形成。桑树再生植株受到轻度低氮胁迫时,MaFPGS的表达量显著增加。研究结果为进一步解析MaFPGS基因的功能奠定了基础。

叶酰聚谷氨酸合成酶基因在甲氨蝶呤对映体获得性耐药A549细胞株中的表达差异

目的研究不同甲氨蝶呤（MTX）对映体耐药与叶酰聚谷氨酸合成酶（FPGS）基因水平表达的关系。方法用大剂量冲击递增结合低剂量持续诱导法诱导获得两组含不同构型15～55μmoL／L浓度的MTX对映体[L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX]耐药的细胞系，细胞为人源非小细胞性肺癌A549细胞，用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各细胞系的耐药指数；用实时荧光定量聚合酶链反应（RFQ—PCR）方法检测这两组各细胞系中胞质型FPGS（cFPGS）和线粒体型FPGS（mFPGS）基因的相对含量。结果D-（-）-MTX耐药细胞组耐药指数高于L-（＋）-MTX耐药细胞组（32．7±9．3比11．54-2．9，P〈0．05），L-（＋）-MTX／A549细胞系耐药指数均在5～15之间，为中度耐药，而D-（-）-MTX／A549细胞系耐药指数均〉15，为高度耐药。在D-（-）-MTX和L-（＋）-MTX两组耐药细胞系中，mFPGS表达水平仅在MTX为15μmol／L时差异无统计学意义，在MTX其他各浓度点两组间差异均有统计学意义（25μmol／L：2．3±0．9比1．3±0．7，35μmoL／L：2．6±0．3比1．1±0．9，45μmol／L：1．4±0．8比1．0±1．0，55μmoL／L；1．0±0．2比0．2±0．1均P〈0．05）；cFPGS表达水平在MTX为15μmol／L时两组间差异也同样无统计学意义，在25～55μmol／L浓度区间内D-（-）-MTX／A549细胞系的cFPGS表达与耐药指数呈现高度负相关（r=-0．95，P〈0．05）。结论在A549细胞中MTX对映体初次剂量15μmol／L冲击法诱导获得的对映体耐药与再次接受更大剂量（t〉25μmol／L）MTX诱导获得耐药的机制不同，D-（-）-MTX／A549耐药细胞系表现为更高的耐药性，提示临床使用MTX时应考虑该药物存在手性对映体问题。

聚-γ-谷氨酸合成酶复合体A的原核表达及其多克隆抗体的制备

以pgsBCA质粒为模板对已知的pgsA进行PCR扩增,得到长度为1 116 bp的片段。将获得的PgsA基因连接到pQE-30表达载体,转化大肠埃希菌后用IPTG诱导其表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析,均可见约42 ku目的蛋白带。通过Ni-NTA agarose纯化,获得较高纯度的重组蛋白,经基因定量仪测定其浓度可达1.5 mg/mL;以其免疫新西兰兔获得免疫血清,Western blot分析证实,该重组蛋白具有良好的反应原性,用间接ELISA检测抗体效价可高达1∶12 800。结果表明,成功获得了pgsA的多克隆抗体。

γ-PGA合成酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

研究了γ-PGA合成酶基因pgsBCA在大肠杆菌中的克隆和表达,以pET28a(+)为载体,构建表达载体pET28a(+)-pgsBCA,导入宿主Escherichia coli Rosetta中,诱导使之表达。将发酵液离心去除菌体,得到上清液用旋转蒸发仪浓缩后,采用SDS-PAGE电泳检测重组菌E.coli Rosetta/pET28a-pgsBCA产生的γ-PGA分子量在200-300kDa之间,将产物水解,采用薄层层析法鉴定产物由单一的谷氨酸组成,表明γ-PGA合成酶基因pgsBCA在大肠杆菌中成功表达。

风湿性疾病患者MDR1、RFC1、GGH、FPGS和MTHFR基因型研究

目的研究中国风湿性疾病患者群中MDR1 C3435T、RFC1 G80A、GGH C-401T、FPGS(rs1544105)G>A、MTHFR C677T和MTHFR A1298C基因型的分布,并与北京汉族健康人群及其他种族的基因频率进行比较,明确种族差异。方法用PCRRFLP的方法检测分析MDR1 3435、RFC1 80、GGH-401、FPGS(rs 1544105)、MTHFR 677和MTHFR 1298五个基因6个位点在中国风湿患者群中的分布情况,并验证是否符合Hardy-Weinberg平衡,同时和北京健康汉族人群及其他种族基因突变频率与等位基因频率的分布进行比较。结果 6个位点等位基因频率如下:MDR1 3435C 64%,MDR1 3435T 36%;RFC1 80G 51%,RFC180A 49%;GGH-401C 81%,GGH-401T 19%;FPGS(rs1544105)G 26%,FPGS(rs1544105)A 74%;MTHFR 677C 73%,MTHFR677T 27%;MTHFR 1298A 79%,MTHFR 1298C 21%。各个基因型频率都符合Hardy-Weinberg平衡。结论除了MTHFR 677的突变频率较低外,本研究风湿患者群中的各基因频率与已报道的北京健康志愿者基因频率相似。各基因频率与其他种族间存在种族差异。