细菌通过聚酮合成酶途径合成多不饱和脂肪酸的研究进展

细菌利用聚酮合成酶途径合成多不饱和脂肪酸是近年发现的新的脂肪酸合成途径。这种途径与常规的由脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶引导的脂肪酸合成途径有着本质上的差别。总结了近些年细菌利用聚酮合成酶合成多不饱和脂肪酸这一新途径的研究状况,重点阐明其分子机制,并对其研究趋势及应用前景进行了展望。

红霉素链霉菌聚酮合成酶基因eryAIII的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryAIII基因。方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryAIII及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:NdeⅠ、HindⅢ分别酶切质粒pET-m28a/eryAIII-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryAIII编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加。结论:GroELS提高了eryAIII编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础。

突变型聚酮合成酶酮还原酶域的表达及序列分析

为验证糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域EryKR1中的控制底物特异性位点,以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增出α6和α7之间的氨基酸残基RHGVIEMP对应的核苷酸序列被替换的EryKR1酶域DNA片段eryKR1M,并克隆到表达载体pET-28a上,构建了质粒pET-ery KR1M,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-ery KR1M)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析表明重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-eryKR1M)中的重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白质的5.7%。E.coli BL21(pET-ery KR1M)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组菌E.coliBL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示突变型的重组菌E.coli BL21(pET-ery KR1M)失去野生型重组菌E.coliBL21(pET-ery KR1)2还原环己酮的能力,结合EryKR1酶域与放线菌素聚酮还原酶ActKR的氨基酸序列比对和二维结构比较的结果,推测α6和α7间氨基酸残基RHGVIEMP为EryKR1酶域中的底物结合口袋组成单元,对酶活性保持非常重要。

两类藻毒素聚酮合成酶遗传相似性及其二级结构预测分析

研究微囊藻毒素聚酮合成酶、节球藻毒素聚酮合成酶之间的遗传关联性,并对其二级结构进行预测分析.应用聚合酶链反应得到2株蓝绿藻的毒素聚酮合成酶(PKS)基因,并进行基因序列分析.从GenBank中提取产微囊藻毒素、产节球藻毒素藻株的相应基因序列,利用DNAStar和phylip软件分析目的基因一致性及2类藻毒素PKS的进化情况.采用Garnier-Robson法、Karplus-Schulz法预测项圈藻株202A1/35、节球藻株NSOR10PKS蛋白片段的二级结构,Kyte-doolittle法分析蛋白的亲水性,Emini法预测蛋白质的表面可能性.结果表明,2类藻毒素PKS目的基因的相似性非常高;项圈藻属、念珠藻属的微囊藻毒素PKS与节球藻毒素PKS的进化关系较近;2种藻毒素PKS分析片段二级结构具有较大的相似性,其亲水性与表面可能性区域等特征也极为相似.

真菌Drechslera catenaria聚酮类代谢产物及聚酮合成酶基因的初步研究

目的分离分析内脐蠕孢真菌(Drechslera catenaria)的次级聚酮类代谢产物,初步分析其非还原型I型聚酮合成酶基因组成,为该菌株中大黄酚生物合成机制的阐明奠定理论基础。方法应用Czapek Dox培养基发酵培养,酸化乙酸乙酯提取,硅胶柱层析及薄层制备等方法,对该菌株产生的聚酮类代谢产物进行分离纯化;利用紫外(UV),液相-质谱联用(LC-MS)和核磁共振谱(1H-NMR)鉴定化学结构;基于真菌聚酮合成酶保守序列设计引物,克隆与代谢产物合成相关的聚酮合成酶基因。结果与结论从试验菌株菌丝体及发酵液中分离获得4个芳香聚酮类化合物,其结构分别为大黄酚(chrysophanol),长蠕孢素(helminthosporin),冰岛青霉素(islandicin),链蠕孢素(catenarin),其中后3个为首次从该真菌中得到。从基因组DNA中得到一段非还原性聚酮合成酶(PKS)基因序列(约5.3kb),与Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP中黄色色素合成相关的基因片段有较高类似度,很有可能与内脐蠕孢真菌中大黄酚的生物合成有关;在距离该基因2.5kb处克隆到一段基因序列(0.79kb),与P.tritici-repentis Pt-1C-BFP中β-酮酯酰基-ACP-还原酶(KR)基因完全相似,其很可能负责大黄素的6位羰基经还原形成大黄酚。

聚酮合成酶应用研究进展

聚酮合成酶在生物活性产物的合成方面有广泛应用,本综述简单介绍了三类聚酮合成酶,并阐述了几例聚酮合成酶应用的原理及合成过程,分别为八酮烯二炔核心结构生物合成应用、增加聚酮合成酶多样性应用和构建"非自然"的天然产物。

聚酮合成酶底物专一性的研究进展

聚酮合成酶能够合成包括许多大环内酯类抗生素在内的聚酮类天然产物,它的结构和功能的模块性为组合生物合成的产生和发展奠定了基础。聚酮合成酶的酰基转移酶功能域可以特异性地决定所选择酰基辅酶A的种类,决定产物的结构。近年来,针对许多来源不同、结构各异的聚酮合成酶的底物专一性已经从氨基酸序列、结构和功能等方面进行了大量的研究,为更有效地应用聚酮合成酶开发新型抗生素奠定了基础。

螺旋霉素聚酮合成酶基因和抗性基因的克隆与表达的研究

根据不同聚酮合成酶基因DNA的同源性,利用放线紫红素聚酮合成酶基因actⅠ,actⅢ作探针,从螺旋霉素产生菌Str.spiramyceticus U-1941 基因文库中检测并分离了螺旋霉素聚酮合成酶基因pCN3H8。限制酶酶切分析表明,其分子量为44kb。通过分子杂交实验,将螺旋霉素聚酮缩合酶基因(与actⅠ有同源性)及聚酮氧化还原酶基因(与actⅢ有同源性)进行了定位。pCN3H8 DNA在麦迪霉素产生菌变株Str.mycarofaciens subsp.68中的表达产物,经紫外光谱分析与麦迪霉素相似。pCN3H8在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株Str.coelicolor TK17中的表达产物,不具有放线紫红素的色素,其纸层析谱型与螺旋霉素有显著差别。pCN3H8在变青链霉菌Str.lividans TK24中的表达产物,也具有抗菌活性。将pCN3H8 DNA转化对螺旋霉素敏感的Str.griseofuscus原生质体,获得了螺旋霉素抗性的表达。从转化子中分离得到了质粒DNA pSG3,其分子量为7.0kb,可能是pCN3H8DNA转化Str.griseofuscus时在体内缺失而形成。再转化实验证明,宿主菌对螺旋霉素的抗性,确实是由于pSG3 DNA作用的结果。含质粒pCG4,pSG3的螺旋霉素产生菌Str.ambofaciens转化子螺旋霉素的产率明显提高。

棉花黄萎菌聚酮合成酶基因的克隆与序列分析

【目的】探索棉花黄萎菌黑色素合成途径中的相关基因。【方法】通过设计多对引物,对新疆棉花黄萎菌强致病力菌株V592进行了聚酮合成酶基因(PKS)的PCR、克隆和测序,并对所测序列进行基因结构及进化分析。【结果】获得真菌DHN黑色素合成途径中的一个关键酶—聚酮合成酶基因(PKS)的全序列,为6 742bp(登录号:KC422576)。序列分析显示,该基因由4个外显子和3个内含子组成,其开放阅读框(OR f)编码2 189个氨基酸;具有I型聚酮合成酶基因(PKS I)的结构特征。以KS编码氨基酸序列构建系统关系树,结果表明产生相同多聚酮次生代谢物质的真菌具有相同的进化来源,V592与产生黑色素(melanin)的其他真菌处于相同的进化分支上,而产生其他次生代谢产物的真菌则分别形成不同的进化分支。【结论】PKS基因与棉花黄萎菌黑色素的产生有关。

药用大黄全长转录组测序分析及Ⅲ型聚酮合成酶家族基因鉴定

目的:利用全长转录组测序技术挖掘药用大黄蒽醌类成分合成中的关键酶Ⅲ型聚酮合成酶(PKSⅢ)家族基因。方法:利用PacBio SequelⅡ平台进行药用大黄全长转录组测序,数据通过非冗余蛋白(NR)、Swiss-Prot、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、真核生物相邻类的聚簇(KOG)、基因本体(GO)数据库进行功能注释。筛选PKSⅢ家族基因全长并进行编码蛋白生物信息特征分析,借助MEGA 6.0构建PKSⅢ家族基因系统发育进化树。结合RNA-Seq数据分析,运用TBtools计算PKSⅢ家族基因的相对表达量。结果:共获得原始数据55.50 GB,52960条高质量转录本,平均长度1712.56 bp;50007条Isoforms在NR、Swiss-Prot、KEGG和KOG数据库中得到注释。GO分类注释到生物过程、细胞组分和分子功能3个类别的65个小组。KEGG代谢通路共有17637条转录本被注释于137条通路中,其中标准次生代谢通路15条。筛选到16个含开放阅读框的Isoforms,编码8个PKSⅢ家族基因,包括RoALS1-3(芦荟松合酶)、RoCHS1-3(查耳酮合酶)、RoSTS(二苯乙烯合酶)和RoPKS(聚酮合成酶)等,编码蛋白长度为391~393 aa,无信号肽或跨膜结构域,均定位于细胞质中。编码蛋白序列保守,磷酸化及糖基化位点和数目各异。大多数PKSⅢ家族基因Isoforms在药用大黄根和根茎中表达量高。药用大黄PKSⅢ家族基因与掌叶大黄、虎杖、拟南芥基因汇于一支,亲缘关系近。结论:获得药用大黄全长转录组信息特征,鉴定了8个药用大黄PKSⅢ家族基因,明确了序列及表达特征,为药用大黄蒽醌类成分合成的分子机制研究提供参考。

细菌Ⅲ型聚酮合成酶研究进展

细菌Ⅲ型聚酮合成酶的发现和研究成为最近10多年微生物天然产物生物合成领域的新热点。细菌Ⅲ型聚酮合成酶根据其产物结构的特点主要分为6类,其中多种Ⅲ型聚酮次级代谢产物具有重要的生物学活性。文章主要对这几类合成不同聚酮骨架的细菌Ⅲ型聚酮合成酶的催化功能、反应条件、产物结构和功能活性等方面进行介绍,对这类聚酮合成酶的进一步研究和应用进行了展望。

海绵体动物中trans-AT聚酮合成酶来源的聚酮化合物的生物合成

海绵体动物分离到的聚酮类化合物很多是由其共生或附生微生物体内的trans-AT聚酮合成酶催化产生的。利用宏基因组技术克隆具有生物活性的聚酮化合物的生物合成基因簇,不但能阐明活性化合物的生物合成路径,而且可以通过异源表达获得目标化合物。本文综述了海绵体动物来源的trans-AT聚酮合成酶产生的聚酮化合物生物合成及其基因簇的研究进展。

梨Ⅲ型聚酮合成酶家族的比较基因组学研究及表达模式分析

植物Ⅲ型聚酮合成酶(PKS Ⅲ)在植物次生代谢产物生物合成中起着非常重要的作用。本研究从7种蔷薇科果树中共鉴定出57个PKS家族成员,随后进行种间比较基因组学分析。基因结构和保守基序分析表明,57个PKS多数由两个外显子和一个内含子组成,都具有PKS特有的保守结构域Chal-sti-synt-N和Chal-sti-synt-C。进化分析显示,57个PKS可明显分为4个亚家族,其中I亚家族成员数目最多。染色体定位及基因复制事件表明,PKS不均匀地分布在2~5条染色体上,且PKS家族进化过程主要受纯化选择作用。荧光定量分析发现,PbPKS4和PbPKS5表达模式与‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri cv.‘Dangshan Su’)不同发育时期果实中木质素及石细胞含量变化趋势类似,因此推测这2个基因在梨果实木质素合成及石细胞发育过程中发挥一定作用。本研究为今后研究蔷薇科果树PKS家族建立了基础,也为从分子水平改善梨果实品质提供了理论依据。

结核分枝杆菌聚酮合成酶13抑制剂的研究进展

在结核分枝杆菌分枝菌酸的生物合成通路中,聚酮合成酶13(polyketide synthase 13,Pks13)起到最后一步的组装作用。通过抑制Pks13可以抑制分枝菌酸的合成,进而起到杀灭结核分枝杆菌的作用。目前已发现五类化学骨架不同的Pks13抑制剂,本文将简要介绍这几类Pks13抑制剂的发现过程、作用机制以及不同抑制剂的构效关系。

聚硫醚酮单体4,4’-二氯二苯酮和4-氯-4’-氟二苯酮的合成研究

对氯苯甲酰氯分别与苯、氯苯和氟苯经Friedel-Crafts酰化反应合成了4-氯二苯酮(CBP)、4,4’-二氯二苯酮(DCBP)和4-氯-4’-氟二苯酮(CFBP),收率都在93%以上,粗品含量在98%以上。所有产品均经熔点、HPLC和NMR氢谱表征。DCBP和CFBP的合成,实验显示二氯乙烷作溶剂的结果较佳。

莲子草假隔链格孢聚酮合成酶基因的筛选、克隆及生物信息学分析

通过对莲子草假隔链格孢转录组测序中聚酮合成酶基因的表达分析,发现编号为Unigene0007998的基因在莲子草假隔链格孢中的表达量远高于其他聚酮合成酶,推测该基因与莲子草假隔链格孢的致病力相关。为进一步了解该基因的功能,本研究克隆了该基因并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。结果表明Unigene0007998编码的蛋白由2089个氨基酸组成,是一种稳定的、亲水性分泌蛋白,不存在跨膜结构。

产生大环聚酮类天然产物放线菌的分子筛选研究

目的 建立一套简便、快速、高效的大环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系 ,为聚酮类药物筛选搭建一个新的技术平台 ;认识 PKS- I基因在不同环境放线菌群中的分布规律 ,为新药筛选中微生物资源的定向分离提供依据。方法 通过对大环聚酮类化合物生物合成途径所用的 I型聚酮合成酶氨基酸和核苷酸序列的同源性比较分析 ,设计了一对引物用于扩增 KS/ AT功能域约 1.6 kb目的基因片段 ,依据放线菌基因组中 I型 PKS合成酶基因的存在与否标定可能的大环聚酮类天然产物产生菌。结果 利用建立的大环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系对 98株嗜碱放线菌、99株链霉菌、46株嗜盐放线菌和 75 7株稀有放线菌进行了筛选 ,研究表明嗜碱放线菌、链霉菌、嗜盐放线菌和稀有放线菌 I型聚酮合成酶基因的阳性率分别为 2 6 .5 %、2 0 .4%、15 .2 %和 9.35 %。结论 利用组合放线菌基因组 DNA快速提取技术和 PKS- I基因兼并引物 PCR扩增技术建立了快速、简便、高效的大环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系 ,并对不同环境条件的放线菌菌群的PKS- I基因分布进行了研究 ,结果不仅表明了放线菌 PKS I聚酮合成酶分布的广泛性 ,而且表明极端环境放线菌 ,尤其是嗜碱放线菌是大环聚酮类化合物潜在的丰富资源 ,为新药筛选有效菌源的确定提供了?

SOE-PCR技术在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的应用

为了验证SOE-PCR技术在洛伐他汀九酮合成酶基因(LOVB)克隆中的应用,以土曲霉基因组DNA为模板,设计4对引物,分别扩增LOVB的4个外显子,并按一定的顺序,利用SOE-PCR技术将其一一串联起来,形成LOVB①-④的cDNA序列.结果表明:重叠延伸PCR成功扩增出了LOVB①-④的cDNA序列,大小1.3kb左右,测序结果和NCBI中登录号为AF151722.1的洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列比对,同源性为98.5%.

洛伐他汀生物合成及其相关基因研究进展

洛伐他汀是一种有效的降胆固醇药物,这种真菌次生代谢产物及其衍生物是胆固醇生物合成限速酶———HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂。文章综述了用同位素标记前体研究洛伐他汀生物合成和洛伐他汀生物合成相关基因的克隆、功能分析等方面的研究进展。

烯二炔类抗肿瘤抗生素的生物合成研究进展

烯二炔类抗生素以其独特的化学结构和强烈的抗肿瘤活性成为化学、生物和医药领域重点关注的对象。本文简要介绍了近年来关于烯二炔化合物的生物合成研究进展,以及运用组合生物合成的原理创造新型烯二炔结构类似物的前景。烯二炔类抗生素为我们研究复杂天然产物的生物合成提供了一个很好的模型,其基因和生化水平机制的阐明将进一步丰富组合生物合成的内容和手段,最终有利于发现和发展新型的抗肿瘤药物。