外泌体miRNA提取方法的建立及优化

目的建立及优化外泌体miRNA的提取方法,并与传统方法进行比较。方法以MSC、NK、CIK细胞外泌体miRNA为研究对象,用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测gDNA去除柱对外泌体miRNA中基因组DNA的去除效果;并以浓度、纯度及基因表达水平(Ct值)为评价指标,优化提取方法中的裂解液(外泌体G2裂解液及外泌体miRNA裂解液)及聚集试剂(无水乙醇及异丙醇)。采用建立的方法、Trizol法及Trizol磁珠法提取MSC、NK、CIK细胞外泌体及健康人血清外泌体miRNA,进行实时荧光定量PCR检测。结果gDNA去除柱可有效去除外泌体miRNA中的基因组DNA。外泌体miRNA裂解液提取MSC、NK、CIK细胞外泌体miRNA的浓度均显著高于外泌体G2裂解液(t=6.358,P=0.020);外泌体G2裂解液提取的miRNA样品纯度均偏低,存在杂蛋白污染,而外泌体miRNA裂解液可有效去除污染;外泌体miRNA裂解液提取CIK细胞外泌体miRNA的miR⁃Let⁃7i、miR⁃16⁃1、miR⁃150基因Ct值明显低于外泌体G2裂解液(t=30.120,P=0.008)。异丙醇提取MSC、NK、CIK细胞外泌体miRNA的浓度明显高于无水乙醇(t=8.567,P=0.010),纯度明显高于无水乙醇(t=6.214,P=0.020);两种聚集试剂提取CIK细胞外泌体miRNA的miR⁃Let⁃7i、miR⁃16⁃1、miR⁃150基因Ct值差异均无统计学意义(t=2.297,P=0.120)。与Trizol法及Trizol磁珠法比较,采用建立方法提取CIK、NK、MSC细胞及健康人血清外泌体miRNA的miR⁃Let⁃7i、miR⁃16⁃1、miR⁃Let⁃7a、miR⁃150基因表达量更丰富,总体Ct值较低;且熔解峰较突出、尖锐,表现为单一主峰。结论采用建立的方法提取的外泌体miRNA具有较高的浓度及纯度,Ct值稳定,且具有较高的灵敏度及良好的特异性。本研究为外泌体miRNA的进一步研究奠定了基础。