用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备

目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。

改良Blue Native PAGE方法的建立及对注射用A型肉毒毒素活性药用成分天然结构的分析

建立具有较高分辨率的温和的Blue native PAGE方法,用于分析国产注射用A型肉毒毒素(商品名为衡力■)复合物活性药用成分(Pharmaceutical active ingredient,API)天然结构。通过改进样品处理方法解决蛋白样品分解的问题。由7种电极缓冲液构成8个组合,从中筛选出最优组合并改进染色方法,电泳结果的分辨率明显提高。以基于改良Blue native PAGE进行二维SDS-PAGE,以基于二维电泳的Western blotting对各组分定性分析,以改良对Blue Native PAGE对A型肉毒毒素API天然结构相对分子质量进行测定。改良Blue Native PAGE方法能够分析注射用A型肉毒毒素API天然结构,明确了注射用A型肉毒毒素API天然结构的存在形态及组成,注射用A型肉毒毒素API相对分子质量为(918±18. 38) k。

注射用A型肉毒毒素比活性与稳定性分析

探究注射用A型肉毒毒素比活性与稳定性。方法 选择二〇二一年至二〇二二年4批BTXA收获物以及20批BTXA原液为研究样本,针对4批BTXA收获物使用银离子交换层析技术处理,对毒素复合体进行分离,结合凝血实验,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、高效液相色谱法和N-末端氨基酸测序等方法对BTXA成分进行分析。结果 A 型肉毒毒素复合体Ⅰ峰、Ⅱ峰、Ⅲ峰,对三个组分的比活性以及血凝效价计算,Ⅰ峰、Ⅱ峰、Ⅲ峰比活性分别为300、1500、125、300,且血凝效价数据依次数352、0、84、0.说明在Ⅰ峰、Ⅲ峰无血凝效价,Ⅱ峰血凝效价较低;TSK SW4000进行检测,A型肉毒毒素复合体均是具有完整性等单一峰型,保留时间15min。其单体纯度≥99.5%;20批BTXA原液比活性平均数据为3.02 × 107 LD50/mg蛋白,且其波动范围较小;成本制作损失率范围在20%-30%,100U成品其中含有毒素蛋白不超过5ng/瓶。结论 注射用A型肉毒毒素属于复合体,具有较高稳定性,BTXA原液制成成品损耗率较低,为今后临床用药提供指导。