重组肉毒毒素E(BoNT/E)重链C端的表达、纯化及其抗原性分析

目的 :克隆、表达并纯化肉毒毒素E重链C端 (BoNT/EHC2 )保护性抗原片段 ,为BoNT/E的抗体制备和检测方法的建立奠定基础。方法 :采用PCR扩增BoNT/EHC2基因 ,插入表达载体 pET2 8a ,转化E .coliBL2 1(DE3) pLysS获得表达工程菌株 ,并对诱导表达条件和纯化条件进行优化。利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT/EHC2的抗原性。结果 :表达工程菌 pET2 8a EHC2 /BL2 1(DE3) pLysS于 37℃用 0 .2mmol/LIPTG诱导 6h ,表达的目的蛋白可以达到全菌蛋白的 37.9%。经过固定化金属螯合亲和层析一步纯化 ,rBoNT/EHC2的纯度可达 95 %以上。Western印迹和间接ELISA显示其具有良好的抗原性。结论 :首次克隆、表达并纯化了BoNT/EHC2片段 ,并可被抗天然BoNT/E马血清所识别 ,为制备相应的抗体及建立快速检测方法做好了准备。

鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

目的：构建鼠源E型肉毒毒素（BoNT/E）免疫噬菌体单链抗体库,筛选BoNT/E特异性抗体。方法：从E型肉毒类毒素免疫小鼠的脾细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,分别扩增出小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因;通过重叠延伸PCR将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成scFv基因,重组于噬粒pS100中,电转化大肠杆菌TG_1,合并所有克隆成初级库;随机挑取克隆进行核苷酸序列测定,对初级库序列多样性进行分析;在辅助噬菌体M_（13）K_（07）的拯救下,构建成scFv噬菌体抗体库;用纯化的BoNT/E对鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库进行3轮富集筛选,制备单克隆的噬菌体抗体颗粒进行酶联免疫吸附试验,阳性克隆进行核苷酸序列测定。结果：鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库的库容为7.09×10^7,随机挑取的20个克隆序列各不相同,序列正确率为85%,基本覆盖了IgHV、IgKV、IgLV的优势家族;纯化的BoNT/E作为抗原通过3轮筛选,噬菌体抗体富集了66倍,第3轮筛选后随机挑取90个克隆制备噬菌体抗体颗粒,酶联免疫吸附试验分析有88个呈现阳性反应,序列比对得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。结论：构建了库容量达7.09×10^7的鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体库,筛选得到了24个不同序列的BoNT/E特异性抗体。

首次自肉毒中毒食品中分离的一株产生E型肉毒毒素的酪酸梭菌

对某卫生防疫站委托本研究室分离病原菌的一份引起肉毒中毒的食品一＂黄豆冬瓜酱＂进行检测和病原菌的分离，从中再次检出了Ｅ型肉毒毒素并分离到一产毒菌种，对该菌种的生物学及生化学特性进行检查，并检测其毒素基因（ＰＣＲ试验）。结果：该分离菌能产生Ｅ型肉毒毒素，ＰＣＲ检测结果也证明其具有Ｅ型肉毒神经毒素基因，但其多项生化特性与Ｅ型肉毒梭菌有明显差异，而与酪酸梭菌完全一致。结果说明该分离菌系产生Ｅ型肉毒毒素的酪酸梭菌，而非Ｅ型肉毒梭菌。由酪酸梭菌引起的食物中毒型肉毒中毒并从中毒食品中分离到该病原菌，这在国际上尚属首次报告。

精制E型肉毒类毒素免疫原不同配制比例实验

目的为获得高效价的马血浆,选择最佳E型肉毒类毒素免疫原配制比例。方法用3种不同配制比例配制E型肉毒类毒素免疫原,免疫原1、2、3分别为V(羊毛脂):V(液体石蜡):V(精制E型肉毒类毒素抗原)=1:2:6,1:2:3,1:2:2。将24匹马分为3组,分别用3种免疫原按常规法免疫,采用小鼠中和试验方法检测马血浆效价。结果用免疫原2免疫的马匹,马血浆平均效价比用免疫原1、3平均效价提高了36.3%,且马匹表现状况好于免疫原1、3。结论免疫原2的配制比例使用安全、稳定性良好、马匹免疫效果较好,为目前抗毒素生产用免疫原最佳配制比例。

胰酶激活的E型肉毒毒素及其类毒素免疫原性研究

目的胰酶激活E型肉毒毒素,并研究其类毒素免疫原性。方法胰酶激活E型肉毒毒素,脱毒后制备类毒素,免疫家兔,与常规方法制备的E型肉毒类毒素比较免疫原性。结果胰酶激活E型肉毒毒素的最佳条件为胰酶浓度0.5%、激活时间45 min、p H 6.0、温度37℃,在此条件下可提高毒素毒力1000倍,但其类毒素免疫原性与常规方法无显著性差异。结论胰酶激活E型肉毒毒素,可大幅度提高毒素毒力,但并未改变其免疫原性。

一起E型肉毒毒素中毒的实验室诊断

目的检测中毒食品中的肉毒毒素,以指导救治。方法按中华人民共和国国家标准GB/T4789.12-2003(食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验),用采集的食物中毒样品对小白鼠进行毒力检测。结果中毒食品中检出E型肉毒毒素。结论根据试验结果很快查明中毒原因,为及时救治中毒患者提供了强有力的依据。

E型肉毒神经毒素(BoNT)基因序列分析及其B细胞表位预测

目的：分析不同E型肉毒梭菌的肉毒神经毒素（BoNT）基因序列的同源性，预测E型BoNT的B细胞表位。方法：用LaserGene软件中的MegAlign程序比对GenBank中5株不同E型肉毒梭菌的BoNT基因序列；分别利用BioSun和LaserGene软件分析E型BoNT的表位参数、蛋白质二级结构及氨基酸序列保守性，利用三维结构显示软件Cn3D，分析E型BoNT可能的B细胞表位的空间定位，进而预测E型BoNT的B细胞表位。结果：5个E型BoNT基因核酸序列同源性为97．2％-100％，氨基酸序列同源性为95％-100％；E型BoNT轻链中的62-78，111-127区段，重链中443-465，661-677，693～709，727-743，853-869，1093-1109，1128-1144，1163-1179区段最有可能是其B细胞优势表位。结论：我们利用不同分析软件，结合多参数综合预测出了E型BoNT的多个B细胞表位，为进一步鉴定E型BoNer的B细胞表位及其多表位疫苗的研究奠定了基础。

不同工艺制备的E型肉毒毒素及其类毒素的免疫原性分析

目的用不同工艺制备E型肉毒毒素,脱毒制备类毒素,并分析其免疫原性。方法分别用菌体内提取法和酸沉淀法制备E型肉毒毒素,进行毒素型特异性检定及毒力测定后,脱毒制备类毒素,参考《中国药典》三部(2010版)进行结合价、蛋白氮(PN)含量、总氮(TN)含量、p H测定及脱毒检查和毒性逆转试验。选择结合价较高的2批类毒素配制3组抗原,经家兔皮下进行基础免疫(共2针)和3程超免疫(2针/程),每针间隔14 d,每程免疫间隔30 d,均于第2针免疫后第20天,经耳缘静脉采血,分离血清,参考《中国药典》三部(2010版)附录ⅪH肉毒抗毒素效价检测法,检测抗体效价。结果 55、120 h菌体内提取毒素(201112001和201112003批)及55、120 h酸沉淀提取毒素(201112002和201112004批)均为E型肉毒毒素,毒力分别为6.2×103、5.0×102、4.5×102、6.5×103 LD50/ml;各组类毒素脱毒检查和毒性逆转试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)规定,55 h酸沉淀提取毒素其类毒素TN、PN含量最高,120 h菌体内提取毒素最低。制备的3组抗原(201112001-1、201112004-1及201112004-2批)抗原结合价分别为900、2 100和900 BU/ml;两种方法制备的类毒素按最高结合价配制抗原,免疫后的血清效价差异无统计学意义(P>0.05),两种方法制备的类毒素按相同结合价配制抗原及同批类毒素配制的不同结合价抗原,免疫后的血清效价差异均有统计学意义(P<0.05)。结论用酸沉淀法从120 h培养液中提取毒素可获得与55 h菌体内提取毒素相同免疫原性的类毒素。酸沉淀法操作简便,更适宜马匹免疫用E型肉毒抗原的规模化生产。

玉树州曲麻莱县玛多乡一起中毒事件调查处理报告

[目的]调查处理玉树州曲麻莱县玛多乡郭杨村发生的肉毒中毒事件。[方法]现场流行病学调查,采集样品和实验室检验。[结果]经动物毒理实验;死者血、胃液均检出E型肉毒毒素。[结论]E型肉毒毒素中毒。

我国首例由丁酸梭菌引起婴儿E型肉毒中毒实验室诊断研究

目的对一起疑似婴儿肉毒中毒进行实验室诊断研究。方法对1例疑似婴儿肉毒中毒病例的粪便、食用过的食品和生活环境涂抹共计30份标本/样品进行梭菌分离鉴定及肉毒毒素检测,对分离菌株进行产毒试验。结果将患儿粪便标本培养物上清液腹腔注射小鼠后可致小鼠出现典型肉毒毒素中毒表现(竖毛、呼吸困难并出现典型的蜂腰、四肢麻痹),继而死亡,且培养物上清液经胰酶处理后毒性增强,表现为小鼠出现中毒及死亡时间较未处理组明显缩短。但培养物上清液经100℃加热处理后再次染毒动物,小鼠未出现中毒和死亡。混合型肉毒毒素诊断血清及单价抗E型肉毒毒素诊断血清可对小鼠起到保护作用。从患儿的粪便标本中分离到G^+芽胞杆菌,该菌在哥伦比亚血平板上呈不规则半透明扁平菌落,边缘根状生长,并携带E型肉毒毒素产毒基因,16S rRNA将其鉴定为丁酸梭菌,产毒试验结果显示该菌株可产E型肉毒毒素。结论该起婴儿中毒事件是由感染产E型肉毒毒素的丁酸梭菌引起。

酪酸梭菌的研究进展

酪酸梭菌为革兰阳性厌氧芽孢杆,作为微生态制剂,在临床有着广泛的应用,可以调理人体胃肠功能;能大幅度降低伪膜性肠炎的发病率;对菌群失调引起的腹泻、抗生素相关性肠炎、便秘等有良好疗效。然而,关于酪酸梭菌引起肉毒中毒,使得酪酸梭菌再次成为研究热点。本研究就酪酸梭菌研究历史、临床应用、致病性等方面作一个简要综述。