大肠杆菌肉碱脱水酶基因的克隆、测序及高效表达

［摘 要］目的 克隆并表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB，测定其DNA序列，将caiB基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET－28a（＋）中，构建表达质粒pETCaiB，转化大肠杆菌BL21（DE3），用1mmol/L异两基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果 克隆得到的肉碱脱水酶编码基因 caiB长度为 1221bp，与文献报道值相比,DNA序列有26个不同，氨基酸序列只有一个不同，即302位的丙氨酸变为苏氨酸。重组菌经IPTG诱导，可高效表达，SDS－PAGE分析表达蛋白相对分子质量约43000，表达产物含量占菌体总蛋白45％以上。结论 得到了高效表达肉碱脱水酶的重组菌，为制备L-肉碱创造了条件。

奇异变形杆菌产L-肉碱脱水酶的培养基优化

为了提高L-肉碱脱水酶的活力,通过单因素实验对影响奇异变形杆菌产L-肉碱脱水酶的碳源、氮源及酶的诱导物等培养基组分进行研究,在此基础上采用二次正交旋转组合设计进行培养基组分优化实验。经二次多项式回归建立模型以及对响应面的优化分析,确定了培养基组分最佳含量为:蛋白胨0.678g/100mL、酵母膏0.961g/100mL、巴豆甜菜碱0.335g/100mL、富马酸盐2.093g/100mL。使用优化后培养基发酵得到的L-肉碱脱水酶活力由最初的1.90U/mL提高到5.32U/mL,且与模型预测值较为接近,进一步证明预测模型的合理性。

肉碱脱水酶突变株的获得及其休止细胞反应条件的优化

对一株产肉碱脱水酶的菌株用溴化乙锭进行诱变 ,并经肉碱选择性培养基进行筛选 ,获得了一株高活性酶活的菌株 ,并进行了休止细胞转化巴豆甜菜碱为L 肉碱的反应条件的研究。实验确定休止细胞的最适反应温度为 30℃～ 32℃ ,pH8.1、0 .0 1mol L磷酸缓冲液 ,时间 8.5～ 10h。最适底物浓度为 6 0mg ml,最适休止细胞浓度为 6 0mg ml(湿重 ) ,产率 4 0 % (摩尔比 )。建立了休止细胞酶反应的表观米氏方程 ,其中Vm =0 .0 0 12 2 5mol (min·15mg菌体 ) ,Km =0 .0 4 0 114mol L。