自体骨髓间充质干细胞和同种异体肋软骨细胞共培养修复五指山小型猪膝关节软骨缺损的实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和肋软骨细胞(costal chondrocytes,CCs)共培养构建组织工程软骨及共培养细胞修复五指山小型猪膝关节软骨缺损的可行性,为临床修复关节软骨缺损提供理论依据和奠定实验基础。方法:密度梯度离心法分离五指山小型猪BMSCs,双酶消化法分离CCs。取第3代BMSCs和第2代CCs,随机分为3组:BMSCs:CCs为1:2的共培养组为A组,单纯CCs为B组,单纯BMSCs为C组。绘制细胞生长曲线图,测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)的能力。将12只五指山小型猪随机分为共培养细胞/胶原膜实验组、胶原膜对照组和空白组。共培养细胞/胶原膜实验组髁间窝软骨缺损处植入共培养细胞/胶原膜,胶原膜对照组单纯植入胶原膜,空白组不做任何植入,于术后第8和16周分别处死6只动物,每组2只。取材行大体观察、软骨组织学评分及病理组织学检测。结果:密度梯度离心法分离的BMSCs生长良好,双酶消化法分离的CCs生物活性良好,共培养细胞生长良好。术后16周共培养细胞/胶原膜实验组修复组织呈透明软骨样,表面光滑平坦,周围软骨及软骨下骨整合良好,而胶原膜对照组和空白组为纤维性修复和无修复。共培养细胞/胶原膜实验组修复组织大体评分明显优于胶原膜对照组和空白组(均P<0.05),胶原膜对照组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:BMSCs,CCs和共培养细胞均适合作为软骨组织工程的种子细胞,其中共培养细胞(BMSCs:CCs为1:2)更具优势;共培养细胞复合胶原膜修复软骨缺损近期效果满意。

牙髓细胞和肋软骨细胞共培养形成组织工程软骨的胶原类型分析

目的 :研究牙髓细胞和肋软骨细胞共培养形成的组织工程软骨的胶原类型。方法 :人肋软骨细胞和牙髓细胞按1∶1的比例用微团法共培养来促进其向软骨细胞分化。应用苦味酸天狼猩红染色,偏正光检测法研究形成的组织工程软骨胶原类型,并与颅颌面区域软骨进行比较。结果:肋软骨细胞和牙髓细胞微团法共培养形成的组织工程软骨中以I型胶原为主,同时包括II和III型胶原纤维,其纤维结构组成与肋软骨、髁突软骨增殖层及颞下颌关节盘的纤维结构相似。结论:肋软骨细胞和牙髓细胞共培养可形成的组织工程软骨,其组织结构与纤维软骨相似。

同种异体肋软骨细胞修复兔膝关节全层软骨缺损的研究

目的观察同种异体肋软骨细胞复合透明质酸钠对兔膝关节全层软骨缺损的修复作用。方法分离、培养肋软骨细胞，鉴定生物学活性。将36只新西兰大白兔制备膝关节全层软骨缺损模型并随机分为3组（n=12）。空白组不进行特殊处理；对照组注入透明质酸钠；实验组注入肋软骨细胞／透明质酸钠复合物。术后第1、2、3个月各组分别随机处死4只兔并获取股骨远端标本，行肉眼大体观察、病理组织学检测，按0’Driseoll，keeleyandsalter法行组织学评分。结果第2代肋软骨细胞阿尔辛蓝、番红O、Ⅱ型胶原染色均呈强阳性。实验组术后第1、2、3个月组织学评分（8．75000±0．50000、14．00000±0．81650、19．00000±0．81650）明显高于对照组（0．75000±0．50000、2．00000±0．81650、5．00000±0．81650）和空白组（0．50000±0．57735、0、0），同一时间点实验组与对照组和空白组组织学评分比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论第2代肋软骨细胞适合作为软骨组织工程的种子细胞；肋软骨细胞复合透明质酸钠修复兔膝关节全层软骨缺损近期效果满意。

同种异体肋软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体外与同种异体肋软骨细胞共培养的微坏境中向软骨细胞分化的可行性。方法分离、培养BMSCs和肋软骨细胞,取第二代BMSCs和肋软骨细胞2∶1混合为实验组,终质量浓度为3×108/L;另取相同浓度的单纯肋软骨细胞为对照组,1×10^8/L浓度的单纯肋软骨细胞为低浓度组,体外培养3个月,观察细胞形态变化,2周时取混合细胞进行组织学鉴定;1、2、3个月后取标本,行大体观察、组织学染色等对新生软骨进行评价。结果获取的两种细胞生物活性良好,实验组2周后BMSCs向软骨细胞转化,1个月后组织学检测显示3组在体外均形成了透明软骨,第1、2个月时实验组新生软骨的平均软骨细胞密度(72.667±1.862、98.333±1.506)均高于对照组(61.000±1.414、84.500±1.049)和低浓度组(49.833±1.941、75.000±0.894),对照组高于低浓度组,差异有统计学意义(P<0.05),3个月时3组间软骨细胞密度差异无统计学意义(98.500±1.049、98.333±0.817、97.333±0.817,P>0.05)。结论BMSCs在体外与同种异体肋软骨细胞共培养的微坏境下,被诱导分化为软骨细胞,两种细胞体外培养可形成透明软骨。

人胚肋软骨静止区细胞的体外培养及生物学特性研究

目的 :研究体外培养的人胚肋软骨静止区细胞的生物学特性及分化规律 ,为组织工程生长板的研究提供种子细胞。方法 :采用Ⅱ型胶原酶消化的方法获取人胚肋软骨静止区细胞 ,观察细胞形态学变化 ;测定细胞生长曲线 ;借助特殊染色、免疫荧光染色的方法了解糖胺聚糖、碱性磷酸酶、Ⅱ型胶原酶的合成情况。结果 :贴壁后细胞呈多角形 ,从第 6代开始绝大多数细胞转变为成纤维细胞状 ,细胞培养至第 2代开始分泌大量Ⅱ型胶原。结论 :体外单层培养的人胚肋软骨静止区细胞具有正常的生长增殖与分化能力 ,可分化至成熟期软骨细胞。

碱性成纤维细胞生长因子对无血清培养大鼠生长板软骨细胞的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)用于无血清培养扩增软骨细胞的可行性及最适质量浓度.方法:分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞(rat costochondral growth plate chondrocyte,RGC).细胞化学和免疫细胞化学染色的方法检测第1代RGC中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达.观察0.1、1.0、10.0和100.0μg/L bFGF对无血清培养RGC形态的影响,并分别用3H-TdR和3H-Proline掺入法检测上述质量浓度bFGF对无血清培养RGC增殖和胶原合成的影响.结果:第1代RGC表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原,保持了软骨细胞的分化表型.随着bFGF质量浓度的增加RGC的形态由多角形变为梭形和圆形.与无血清对照组相比,上述4个质量浓度的bFGF均显著促进RGC的增殖和胶原合成(P＜0.05),其中1.0和10.0μg/L bFGF促RGC增殖的作用与10%胎牛血清(FBS)对照组差异无显著性意义(P＞0.05),但促胶原合成作用较弱,相当于10%FBS对照组的60%左右(P＜0.05).结论:bFGF可用于无血清扩增软骨细胞,1.0～10.0 μg/L是适宜的质量浓度范围,但其促胶原合成作用较弱,还需添加其他因子以弥补促胶原合成作用的不足.