抗人心肌肌凝蛋白轻链Ⅰ单克隆抗体的制备和鉴定

以人心肌肌凝蛋白轻链I免疫Balb/c小鼠,取其脾淋巴细胞与NS-1细胞融合,经过筛选、克隆化和再克隆已获得3-D_3、2-D_9、1-E_(10)和2-E_(10)等4个分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经免疫酶标和放免方法测定抗体工作滴度为1:1万。流动式荧光密度计检测NS-1、小鼠脾和杂交瘤细胞DNA的含量,结果表明杂交瘤细胞的DNA含量相当于NS-1和小鼠脾细胞DNA含量之和。杂文瘤细胞传代半年以上稳定地分泌特异性的单克隆抗体。用两个单抗进行了抗原双决定簇的放免測定,并制备了高效价的小鼠腹水。

人心肌肌凝蛋白轻链的提纯及其抗体的制备

从人心肌中提纯的肌凝蛋白轻链(myosin-light chain,M-LC),SDS聚丙烯酰胺凝胶电脉呈三条蛋白带。经DEAE-纤维素柱层析出现三个峰。免疫白兔产生的抗血清,琼脂双扩散鉴定有一条沉淀线;亲和层析,用盐酸胍解离下一个抗体蛋白峰。

梗塞心肌摄取锝标抗心肌肌凝蛋白轻链mAb^(99)Tc^m-AMLCA的影响因素

目的 :探讨注射锝标抗心肌肌凝蛋白轻链单克隆抗体 (99Tcm AMLCA)后不同时间 ,梗死时间和梗死区域对大鼠梗死心肌摄取99Tcm AMLCA的影响 .方法 :大鼠静脉注射99Tcm AMLCA 7.4MBq ,观察不同注射时间 (2 ,4 ,8,2 4h) ,不同梗死时间 (心梗后 6 ,12h ,1～ 14d)和不同梗死区域 (梗死中央、周边的内层心肌和外层心肌 )对梗死心肌 /正常心肌发射性比的影响 .结果 :注射后 2h梗死心肌开始摄取99Tcm AMLCA ,梗死心肌 /正常心肌发射性比是 1.6 7± 0 .96 ,4～ 8h摄取逐渐增加 ,2 4h达到高峰 ,梗死心肌 /正常心肌发射性比是 4 .38± 0 .80 .心肌梗死后 6h～ 14d ,梗死心肌均有很强的99Tcm AMLCA摄取 ,心梗后 5d摄取最强 ,梗死心肌 /正常心肌发射性比是3.82± 0 .6 7;梗死中央区内层心肌的放射性摄取比值是 4 .5 2± 0 .6 0 ,外层心肌是 3.32± 0 .5 8两者具有统计学显著意义 (P<0 .0 1) .结论 :急性心肌梗死大鼠梗死心肌特异性地摄取99Tcm AMLCA迅速持久 ,不受心梗时间影响 ,梗死中央区内层心肌摄取最强 ,为99Tcm AMLCA亲梗死心肌显像临床应用提供了实验依据 .

人心肌肌凝蛋白轻链的分离提纯与鉴定研究

参考采用Schoβler方法并加以改进,分别应用等电点沉淀法、快速蛋白质液相层析(FPLC)及SDS聚丙烯酰胺凝胶制备电泳三种方法分离提纯肌凝蛋白轻链(CMLC),其各具有不同的优缺点,并对CMLC做了鉴定。同时证明在-20℃条件下,冻存时间较长或蛋白浓度较低的CMLC容易降解。

人心肌肌凝蛋白轻链测定在急性心肌梗塞诊断中的应用

应用特异性抗体建达了人心肌肌凝蛋白轻链的双相非竞争性酶联免疫吸附分析,并检测了20例健康人和11例急性心肌梗塞患者的血清心肌肌凝蛋白轻链。结果在健康人血清中未见有可测定的心肌肌凝蛋白轻链存在。而所有急性心肌梗塞患者发病后6～12小时血清心肌肌凝蛋白轻链水平开始升高,其释放形式均呈双峰图形,高水平的心肌肌凝蛋白轻链在病人血中保持11±3天。心肌肌凝蛋白轻链具有高度的敏感性、特异性,而且急性心肌梗塞发病后它在血中出现早、持续时间长,因而是诊断急性心肌梗塞理想的生化指标。

人心肌肌凝蛋白轻链的分离和鉴定

用一种简便易行的方法提纯了人心肌肌凝蛋白轻链。采用稀释方法先粗提纯肌凝蛋白,并用4M脲使它裂解为轻链和重链两部分,离心后,上清液中的轻链再用等电点法沉淀出来,经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,并直接用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制备了轻链。

人心肌肌凝蛋白轻链的生化特性及其临床意义

测定人心肌肌凝蛋白（Ｍｙｏｓｉｎ）、肌凝蛋白轻链（Ｍ－ＬＣ）、重链（Ｍ－ＨＣ）的ＡＴＰ酶活性，结果Ｍ－ＬＣ的Ｍ－ＬＣＡＴＰ酶活性略高于肌凝蛋白ＡＴＰ酶活性，Ｍ－ＨＣ无ＡＴＰ酶活性。同时采用ＥＬＩＳＡ方法测定９６例正常人及４７例心肌梗塞病人，结果正常人血清Ｍ－ＬＣ１平均值为５．９６ｎｇ／ｍｌ，心肌梗塞病人为７３．５ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．００１）。心肌酶谱与Ｍ－ＬＣ１对心肌梗塞诊断符合率比较，Ｍ－ＬＣ１诊断符合率为１００％，ＣＰＫ同功酶ＭＢ为９０．６％。本组制备的单抗与兔心肌肌凝蛋白无交叉反应，抗鸡心肌Ｍ－ＬＣ的单抗与本组提纯的Ｍ－ＬＣ１亦无亲和反应，说明人心肌Ｍ－ＬＣ１单抗具有种属特异性。

鹿茸多肽介导心肌干细胞分化对终末心肌分化基因ANP和MLC-2v表达的影响

目的:探讨鹿茸多肽介导心肌干细胞(CSC)分化对终末心肌分化基因心房钠尿肽(ANP)和心肌肌凝蛋白轻链2(MLC-2v)表达的影响,阐明其修复受损心肌的作用机制。方法:选取出生2d的雄性Wistar大鼠,提取CSC,免疫荧光鉴定CSC表面标志物c-Kit,流式细胞术鉴定CSC纯度。以培养皿为实验单位,分为空白对照组(加等量缓冲液)、5-氮胞苷组(终浓度3μmol·L-1)、鹿茸多肽组(终浓度800mg·L-1)和联合组(3μmol·L-1 5-氮胞苷+800mg·L-1鹿茸多肽),于37℃、5%CO2培养箱中培养48h。ELISA法检测各组细胞上清液中ANP和MLC-2v表达水平,RT-PCR法检测各组细胞中ANP和MLC-2v mRNA表达水平。结果:获得纯度>95%的CSC。ELISA法检测,与空白对照组比较,5-氮胞苷组、鹿茸多肽组和联合组细胞上清中ANP和MLC-2v表达水平明显升高(P<0.05);联合组ANP和MLC-2v表达水平高于5-氮胞苷组和鹿茸多肽组,但差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR法检测,与空白对照组比较,5-氮胞苷组、鹿茸多肽组和联合组ANP和MLC-2vmRNA表达水平明显升高(P<0.05)。结论:鹿茸多肽可以通过增强心肌分化基因ANP和MLC-2v表达介导CSC分化为心肌细胞,且在一定程度上减轻5-氮胞苷所致的细胞毒性。

心肌特异性启动子引导的rNIS基因的摄碘动力学研究

目的构建肌凝蛋白轻链蛋白-2(myosin light chain-2,MLC-2p)启动子调控的钠/碘转运体(sodium/iodide symporter,NIS)的腺相关病毒载体,探讨外源基因在心肌细胞中特异性表达的可行性。方法构建rAAV9-rMLC-2p-rNIS及rAAV9-CMV-rNIS重组腺相关病毒,经酶切鉴定及效价测定。rAAV9-rMLC-2p-rNIS及rAAV9-CMV-rNIS体外感染心肌细胞和非心肌细胞,行动态摄碘及NaClO4抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性。结果成功构建rAAV9-rMLC-2p-rNIS及rAAV9-CMV-rNIS,测得效价为rAAV9-rMLC-2p-rNIS 2.46×1012μg/ml,rAAV9-CMV-rNIS 4.21×1012μg/ml。动态摄碘实验表明感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌细胞的Na125I摄取明显高于非心肌细胞,且能被NaClO4特异性抑制,证实了rMLC-2p启动子的心肌特异性及转染细胞表达的rNIS蛋白有功能。结论成功构建了MLC-2p启动子调控NIS的腺相关病毒载体,证实了外源基因在心肌细胞中的特异性表达,为进一步以该报告基因系统的体内动物实验打下基础。

心肌特异性hVEGF_(165)真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建MLC-2v启动子驱动的真核表达载体并鉴定特异性。方法:用MLC-2v启动子基因片段替代质粒 pIRES2-EGFP的CMV启动子,而保留其增强子序列,并将目的基因hVEGF165分别克隆到两种启动子驱动的质粒,构建 MLC-2v／pIRES2-EGFP-hVEGF165和pIRES2-EGFP-hVEGF1652种质粒,瞬时转染心肌、内皮、平滑肌和成纤维细胞。结果: 转染pIRES2-EGFP-hVEGF165,4种细胞均表达、目的基因及产物;而转染MLC-2v／pIRES2-EGFP-hVEGF165,仅心肌细胞表达GFP和目的基因产物。结论:MLC-2v启动子驱动的质粒可心肌特异表达目的基因及蛋白。

亲梗死心肌放射免疫显像的研究进展

放射性核素标记抗心肌肌凝蛋白抗体（AMA）、抗心肌肌凝蛋白轻链抗体（AMLCA）、抗心肌肌凝蛋白重链抗体（AMHCA）、抗肌钙蛋白I抗体（AcTnIMA）、抗肌钙蛋白T抗体（AcTnTMA）及其片段进行心肌放射免疫显像（RII）对各种原因所致的心肌损伤特别是心肌梗死（MI）的诊断、疗效及预后的评估具有重要价值,但这些单克隆抗体（McAb）显像诊断有诸多缺点, 使其临床应用受到限制.噬菌体抗体库技术,为生产理想的scFv及发挥抗体RII在心脏病学中的作用带来了新的曙光.

CMLC夹心酶联免疫分析的建立及初步应用

目的建立人心肌肌凝蛋白轻链（CMLC）夹心酶联免疫分析方法并初步进行应用研究。方法通过对鼠抗人CMLC单克隆抗体（McAb）的相加指数、亲和常数进行测定和夹心实验,筛选到配对较好的两对CMLC单抗,在此基础上建立了CMLC夹心酶联免疫分析方法,用该方法对心肌梗塞病人和正常人血清CMLC进行测定。结果最佳CMLC单抗包被浓度为5～7μg/mL,CMLC抗原在1～50ng/mL范围内标准曲线线性良好。血清CMLC测定OD值：正常人（20名）为（0.875±0.162）,心肌梗塞病人（30名）为（1.463±0.473）。结论此方法可以检测出人血清中CMLC的含量,重复性好,灵敏度高,是临床诊断心肌梗塞的良好方法。