野大麦肌动蛋白基因片段的克隆及其表达特征分析

野大麦(Hordeum brevisubulatum)是重要的野生禾本科牧草,具有多种抗逆性。为深入挖掘野大麦的抗逆基因,本研究以RT-PCR法克隆了野大麦肌动蛋白基因(Actin,ACT)的核心片段。采用BLAST序列比对,qRT-PCR实时定量方法对其序列特征和表达特性进行了分析。结果表明,野大麦ACT的基因片段长518 bp,编码171个氨基酸。BLAST分析表明,野大麦的肌动蛋白基因片段与大麦(Hordeum vulgare)ACT基因核苷酸序列的一致性达97%,与ACT蛋白氨基酸序列的同源性达91%,并将其命名为HbACT。与11种相关植物进行ACT氨基酸序列比对发现,HbACT含152个保守氨基酸和19个非保守氨基酸,说明HbACT蛋白具有高度保守性。qRT-PCR分析表明,在不同盐浓度处理条件下,不同处理时间野大麦各器官的HbACT的Ct平均值为19.30,地上部的变异系数为3.5,峰度系数为0.262;地下部的变异系数为5.3,峰度系数为0.409,均属于尖峰分布,Ct值的稳定系数均小于1.7。综上所述,HbACT基因表达稳定,可作为内参基因用于研究野大麦功能基因的表达模式分析。

鳜鱼(Siniperca chuatsi)β-肌动蛋白基因cDNA全序列与5′侧翼区的克隆与分析

采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆鳜鱼β-肌动蛋白基因cDNA全序列,再用基因组步行法(Genome Walker)克隆鳜鱼β-肌动蛋白基因5′调控区。序列分析结果表明,鳜鱼β-肌动蛋白基因全长1897bp,其中5′-UTR长94bp,3′-UTR长675bp,编码区长1128bp,编码375个氨基酸。将所得序列与其它动物类群的β-肌动蛋白基因序列进行比较分析显示,鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类等不同类群脊椎动物β-肌动蛋白氨基酸序列同源性均在96%以上,说明该基因在生物进化过程中高度保守。通过鳜鱼与其它脊椎动物β-肌动蛋白基因的核苷酸序列构建的进化树显示,脊椎动物β-肌动蛋白聚类成3个分支,鱼类β-肌动蛋白基因形成一个独立的分化群,说明鱼类β-肌动蛋白基因起源于一个共同祖先。克隆得到的鳜鱼β-肌动蛋白基因5'侧翼序列长1399bp,对其进行序列分析,在其起始密码字ATG上游200bp范围内发现含有CAATbox、CC(A/T)6GG(CArGbox)、TATA box对转录调控起重要作用的顺式元件,同时在侧翼区也发现含有GC box、MYOD、YY1、SP1、GATA等多个潜在调控元件。鳜鱼β-肌动蛋白基因5′侧翼序列的克隆成功,为今后转基因鳜鱼的研究工作奠定了基础。

结缕草肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,提取结缕草叶片的总RNA,进行RT-PCR。并采用RACE技术扩增出1 560 bp的Actin基因全长cDNA序列。序列分析表明,该基因的开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区117 bp,3′非编码区309 bp。所得序列与GenBank中收录的其他植物肌动蛋白核苷酸序列的一致性均在85%以上,氨基酸序列的一致性高达97%以上。将其命名为ZjACT,GenBank登录号为GU290545。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示,结缕草肌动蛋白与大麦和圆锥小麦肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。进一步分离克隆了结缕草Actin基因的基因组DNA序列(登录号GU290546),它由4个外显子和3个内含子组成。本研究有助于揭示植物Actin基因家族的进化历史,为研究植物Actin基因家族功能和进化上的多样性奠定理论基础,同时也为开展草坪草和牧草Actin基因的功能分析和利用研究提供参考。

缢蛏(Sinonovacula constricta)cDNA文库的构建及肌动蛋白基因的研究

采用SMART(switching metchanism at 5’end of RNA transcript)技术构建缢蛏cDNA基因文库。并对cDNA文库的滴度,重组率和插入片段的大小进行了检测。结果表明,该cDNA文库的滴度为5.50×104cfu/ml,重组率为92.5%,插入片段的长度大多在1kb以上。对478个克隆子进行了测序,共得到430个有效序列,其中166个序列无同源性,264条序列具有同源性。从中得到肌动蛋白(actin)cDNA的全长1538bp,开放阅读框(ORF)为1131bp,编码376个氨基酸,其预测蛋白的分子量为41.78kD,等电点为5.30。该氨基酸序列与其它物种的同源性大都在90%以上。

拒盐型盐生植物小花碱茅肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

本研究根据其它植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以拒盐型盐生植物小花碱茅根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序,在GenBank中注册;序列分析结果表明:该片段长约600bp,编码198个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的其它植物Actin基因序列同源性均在84%以上,与其它肌动蛋白的氨基酸序列同源性达94%以上。

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1483bp,由长92bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257bp的3′非翻译区,和1134bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%～99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。

谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以谷子 (Setariaitalica)为材料 ,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物 ,用 5’RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序 ,序列分析结果表明 :谷子肌动蛋白基因的编码区长 1 1 3 1个核苷酸 ,编码了 3 77个氨基酸 ;所得序列 (命名为MIAc)与GenBank中注册的肌动蛋白基因序列的相似性均在 6 0 %以上 ,与其它肌动蛋白氨基酸序列的相似性达 89%以上。根据高等植物肌动蛋白序列相似性重建了进化树 ,表明谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体RAc2和RAc3之间的亲缘关系最为密切 。

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明:白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75%以上,氨基酸序列同源性在85%以上,具有高度保守性。

皱纹盘鲍肌动蛋白基因启动子的克隆和序列分析

从皱纹盘鲍雌性个体的足部肌肉提取总ＤＮＡ后，通过聚合酶连式反应（ＰＣＲ）技术扩增得到一个扩增产 物。经克隆、筛选、确定重组子产物。测序得到了长度为５１１ｂｐ的启动子片段。分析测序结果发现，皱纹盘鲍 肌动蛋白基因启动子ＤＮＡ序列与目前已知的红鲍相应序列的相似度为９５％；ＯＣ碱基含量为３８．９３％，较红 鲍的低（５９．２％）；所得序列含有高度保守的基本表达调控元件，即一个ＣＡＡＴ框和四个：ＴＡＴＡ框。

国兰肌动蛋白基因片段的克隆与表达分析

根据兰科植物(Orchidaceae)蝴蝶兰(Phalaenopsis)的肌动蛋白基因(Actin)序列设计跨内含子引物,分别以cDNA第一链和基因组DNA为模板,采用RT-PCR和PCR方法从墨兰(Cymbidium sinense)、春兰(C.goeringii)中分离出Actin基因的同源片段。序列分析结果表明:墨兰和春兰Actin基因片段长度均为1335 bp,其中编码区长度均为1086 bp,编码362个氨基酸,分别命名为CsACT1和CgACT1(GenBank登录号分别为GU181353、GU181354)。CsACT1和CgACT1均含有3个内含子,且内含子位置非常保守。其氨基酸序列与其他植物的同源性均在90%以上,具有高度的保守性。CsACT1和CgACT1在根、茎、叶、花梗、花蕾以及花器官中都有表达,且表达量基本一致,因此,推断其为组成型表达的肌动蛋白基因。

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。

大叶龙茶解剖学、肌动蛋白基因及分子标记的研究

大叶龙茶是来源于江西修水茶科所宁州群体茶园中一株自然突变体形成的大叶并无蕾无性繁殖新品种。对大叶龙茶及其母株的成熟叶片和不同时期的芽进行石蜡切片研究表明,大叶龙茶叶片栅栏组织细胞较长、海绵组织层数增加;大叶龙茶无蕾的原因是由于所有的芽始终保持营养芽的状态所致。首次克隆了茶树3个肌动蛋白基因片段(CS-ACT1,CS-ACT2,CS-ACT3),且都编码225个氨基酸,大叶龙茶与母株及500个BlastX分析获得的肌动蛋白序列在保守结构域F、G、H区有相应的四个氨基酸不同。对大叶龙茶及其母株进行AFLP分析表明,大叶龙茶总带数比母株少,并出现一部分特有带;利用EST-SSR分子标记技术对大叶龙茶及其它常见品种进行研究,表明大叶龙茶等4个修水品种与龙井43有相似的遗传基础。

蒙古冰草肌动蛋白基因(MwACT2)克隆与表达分析

本研究应用RT-PCR和RACE技术,从蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)中分离到1个肌动蛋白基因,命名为MwACT2。序列分析表明:MwACT2基因全长1506bp,含有1个1131bp的开放型阅读框,MwACT2蛋白长度为376个氨基酸残基,分子量为41.606KDa,理论等电点为5.29,含有actin保守位点,属于actin家族成员。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中乌拉尔图(Triticum_urartu)肌动蛋白(登录号:EMS62134.1)氨基酸具有99%的一致性,属于非跨膜蛋白。利用半定量RT-PCR技术分析MwACT2基因的表达,结果表明该基因表达稳定,经高盐、干旱、低温处理后的表达强度无显著差异。

茶树肌动蛋白基因(CsActin1)全长cDNA克隆与生物信息学分析

以茶树(Camellia sinensis)萌动芽为材料,根据茶树萌动芽芽抑制消减杂交文库中分离得到的肌动蛋白(actin)基因的5'-片段设计引物,利用3'-RACE技术克隆了其cDNA全长序列,该基因cDNA全长1 470 bp,命名为CsActin1(GenBank登录号HQ235647)。序列分析表明,CsActin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,5'非编码区100 bp,3'非编码区236 bp。推测的蛋白质分子量为41.70 kD,等电点约为5.31,具有肌动蛋白家族的特征信号序列(YVGDEAQs.KRG和WIAKaEYDE)和肌动蛋白相关蛋白的特征信号序列(LLTEApLNPkaNR)。CsActin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在80%以上,氨基酸序列相似性在95%以上。与其它植物肌动蛋白的进化树分析结果表明,茶树肌动蛋白与杨树的两个肌动蛋白间的亲缘关系最为密切。并对推导的蛋白结构进行了分析。

八棱海棠肌动蛋白基因(MrACT)的克隆及分析

以八棱海棠(Malus micromalus Makino)为材料,抽取RNA,反转录成cDNA。采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法,5’-RACE获得长度1121bp的片段、3’-RACE获得883bp的片段,再通过设计引物扩增得到八棱海棠中一种肌动蛋白基因的cDNA的全长序列。该序列全长1134bp,推测其编码377个氨基酸,等电点为5.16,其编码的氨基酸与拟南芥(Arabidopsis thaliana)actin7编码的氨基酸只有2个氨基酸差别。通过对八棱海棠MrACT基因的表达分析,发现在不同组织中,该基因的表达水平没有明显差异,本文为进一步利用RT-PCR技术,以MrACT基因为内标,研究八棱海棠其他基因的丰度打好基础。

利用简并引物克隆黑莓、树莓肌动蛋白基因片段及表达分析

采用同源克隆法,利用设计的一对肌动蛋白(actin)基因简并引物,从黑莓、树莓和悬钩子杂种3个悬钩子植物品种均得到一条743 bp的actin cDNA片段,推测编码247个氨基酸。序列比对发现,克隆的actin基因推导的氨基酸序列和其他植物的肌动蛋白氨基酸序列具有高度保守性,经数据库搜索后将来自黑莓和树莓品种的actin cDNA片段在GenBank中登录,登录号分别为HQ439558和HQ439559。不同来源的植物actin蛋白系统进化树的聚类结果表明,树莓和悬钩子杂种亲缘关系较为密切。actin基因在3个悬钩子植物品种不同组织中的RT-PCR分析结果表明,其在检测的不同组织中均有一定程度的表达量,可能都属于组成型表达的肌动蛋白基因。研究结果为利用actin基因作为内参进一步研究黑莓和树莓其他基因的丰度奠定基础。

紫花苜蓿肌动蛋白基因的提取

选取紫花苜蓿叶片为材料,提取总RNA,利用蒺藜状苜蓿的肌动蛋白基因设计特异性引物,扩增出目的基因的cDNA进行测序,测序结果在NCBI基因库中利用Blast与其他高等植物肌动蛋白基因序列进行了比对、分析,结果证明所提取的基因为紫花苜蓿肌动蛋白基因的片段。

在丝瓜和黄瓜发育过程中肌动蛋白基因的表达

对肌动蛋白基因在丝瓜（Ｌｕｆｆａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ Ｌ．）和黄瓜（Ｃｕｃｕｍ ｉｓ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）各器官的表达进行了研究．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔｂｌｏｔ结果表明，肌动蛋白基因在丝瓜和黄瓜中表现出器官特异性表达． 首先，肌动蛋白基因在丝瓜幼苗发育过程中表现明显的发育阶段特异性． ３０ ｄ 苗茎的ｍ ＲＮＡ 水平为８ ｄ 苗的根、子叶和１５ ｄ 苗的根、下胚轴的４～６ 倍， 同时为开花植株茎和叶片的ｍ ＲＮＡ 水平的１０～１２ 倍． 其次，肌动蛋白基因在黄瓜中表现器官特异性表达，它们倾向于在黄瓜幼嫩果实中（开花后１５

褐飞虱Nilaparvata lugens(S"非汉字符号"l)肌动蛋白基因3′-RACE及基因表达的RT-PCR检测

通过锚定的 3′ RACE筛选实验 ,确定锚定效率最好的下游引物 ,用于褐飞虱各发育期肌动蛋白基因表达的RT PCR检测。结果表明 :3个锚定引物中 ,0 4 2 2 7( 5′ >TCACACAGGAAACAGCTATGACTTTTTTTTTTTTTTA <3′)的锚定效率最好 ,可以扩增出 5条褐飞虱的肌动蛋白基因 3′末端片段 ,依其大小命名为BPH A、BPH B、BPH C、BPH D、BPH E。RT PCR检测表明 :BPH A从 3龄开始到成虫期都有常量表达 ;BPH B、BPH C、BPH E从 2龄开始到成虫期都有表达 ;BPH D在整个幼虫期都有表达 。

白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段的克隆及其作为基因表达内参照的应用

目的获取白纹伊蚊β-肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用。方法根据昆虫β-肌动蛋白核苷酸序列的高度保守区设计引物,通过PCR的方法从白纹伊蚊C6/36细胞中扩增获得白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR的方法验证其在稳定转染空载体和40S核糖体蛋白S4(RPS4)基因的白纹伊蚊C6/36细胞中的表达。结果获得白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,长911 bp,与其他几种蚊β-肌动蛋白基因对应序列的相似性在89%以上。在稳定转染空载体和RPS4基因的C6/36细胞中,均可稳定地扩增出目的基因。结论成功获得了白纹伊蚊β-肌动蛋白基因片段,并且该片段完全可以用作基因表达差异分析时的内参照基因。