兔角膜基质飞秒激光扫描后Ki-67、转化生长因子β2及平滑肌肌动蛋白的表达

目的研究角膜基质飞秒激光扫描后Ki-67、转化生长因子β2及平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况，探讨角膜基质内扫描后角膜创伤愈合反应机制。方法20只纯种新西兰大白兔随机编号，35只眼用60kHzIntralase飞秒激光进行角膜基质内扫描（其中5只兔只做右眼），未手术的5只左眼作为正常对照组。激光参数为：点／线间距10μm，扫描直径8．5mm，扫描能量1．3μJ，扫描深度为135μm，不进行角膜边缘切削。术后在30min、1h,2h、1个月和3个月用裂隙灯显微镜观察角膜的透明程度。分别在术后1d．3d、1周、1个月和3个月各取6只术眼的角膜组织，做免疫印迹法蛋白定量检查，各时间点取1只术眼做免疫组织化学检查，分别观察Ki-67、TGF-β2及α-SMA的表达情况。用两组完全随机化设计资料均数的t检验进行统计学处理。结果免疫印迹法蛋白定量及免疫组织化学检查显示：Ki-67在基质扫描后第1天开始表达增加（0．0670±0．0008），扫描后3d达最高峰（0．6923±0．0051），随着时间推移其表达逐渐减少，但直至术后3个月和对照组相比差异均有统计学意义（t=24．12，57．22，43．26，39．78，18．35；P〈0．05）。TGF-β2（t=0．933，0．856，0．934，0．970，1．132）及OL-SMA（t=1．126，1．235，0．993，1．175，1．211）在术后各时间点的表达和对照组相比差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论角膜基质内飞秒激光扫描后Ki-67表达增加，角膜基质细胞活化、增殖；TGF—β2被完整的角膜上皮所屏障，活化和增生的角膜基质细胞没有向肌成纤维母细胞转化，损伤修复愈合过程中无haze形成。

绿色荧光蛋白标记的Raw264.7体外诱导分化为破骨细胞的实验研究

目的 观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）标记的Raw264.7体外分化为破骨细胞的能力,拟为EGFP基因作标志物对外源性破骨前体细胞进行体内追踪做准备.方法 利用反转录病毒介导pEGFP-Lifeact基因转染Raw264.7细胞;采用有限稀释技术,荧光显微镜下获得EGFP稳定转染的G3单克隆细胞并观察其形态,将稳定转染成功的细胞定为G3-EGFP转染组,未转染野生细胞作为对照组;核因子κB受体激活子配体（receptor activator of nuclear factor kappaB ligand,RANKL）诱导G3细胞向破骨细胞分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色、蛋白质印迹法检测组织蛋白酶K、骨吸收陷窝实验观察转染后对破骨细胞形成和骨吸收功能的影响;激光共聚焦显微镜实时拍摄转染细胞向破骨细胞分化过程中伪足小体结构变化的动态影像.结果 Raw264.7细胞内成功转染EGFP-Lifeact,传至20代以上仍可稳定表达EGFP,建立了G3-EGFP单克隆细胞株;转染细胞无明显形态学变化,能诱导形成TRAP染色阳性的多核巨细胞,转染组细胞融合率为（35±5）％,对照组细胞融合率为（39±5）％,二者差异无统计学意义（P＞0.05）;免疫印迹实验中对照组与转染组中组织蛋白酶K/β-肌动蛋白半定量分析比值分别为0.83±0.07、1.02±0.08,两组细胞组织蛋白酶K表达差异无统计学意义（P＞0.05）;对照组与转染组骨吸收总面积分别为272 252±36 193和262 408±23 243（P＞0.05）,骨吸收陷窝数目分别为320±51和339±55 （P＞0.05）,表明转染不影响破骨细胞形成与骨吸收功能;激光共聚焦显微镜实时拍摄显示转染细胞向破骨细胞分化时不断发生细胞融合,伪足小体作为动态自组装结构不断发生改建,最初聚集形成伪足小体簇,逐渐形成环状结构,最终于成熟破骨细胞周围形成相对稳定的伪足小体带.结论 EGFP可成功标记Raw264.7细胞;转染并不影响Raw264.7细胞向破骨细胞分化的能力.