拟南芥肌动蛋白相关蛋白基因AtARP5和AtARP6共同参与DNA复制

染色质重塑因子是一类利用ATP水解的能量主动重塑染色质结构的蛋白质,其中的INO80亚家族包括两个在进化中高度保守的重要成员,INO80和SWR1.两者通过结合包括肌动蛋白相关蛋白(Actin-Related Protein,ARP)在内的多个亚基,以复合物的形式对染色质结构动态调控,在真核生物的多个表观遗传调控途径中发挥重要的功能.尽管都属于ARP成员,ARP5是INO80重塑复合物的特异性成员,而ARP6是SWR1重塑复合物的特异性成员.在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,AtINO80和AtPIE1(拟南芥SWR1)基因缺失的双突变体致死.我们构建了AtARP5和AtARP6缺失突变体的双突变体atarp5-2 atarp6-1,用以研究两者在植物生长发育中的功能互作.我们发现,相对于野生型植物和各自的单突变体,双突变体atarp5-2 atarp6-1植物生长明显受抑制.细致的细胞观察显示,双突变体植物叶肉栅栏细胞大小和数量都减小,植物细胞核倍性下降,细胞周期和DNA复制相关基因的转录水平异常上调.Pull-down实验和BiFC实验证实,AtARP5和AtARP6都能够与DNA解旋酶RVB1结合.由于RVB1对于细胞增殖和植物生长至关重要,因此两个不同的肌动蛋白相关蛋白可能依赖于RVB1协同调控DNA复制以及相关细胞周期进程.

大鲵皮肤cDNA文库构建及Arpc5l基因cDNA序列和组织表达分析

以健康大鲵背部皮肤为材料,采用Smart技术构建大鲵皮肤cDNA文库,经检测文库容量为1.50×106cfu,文库重组率为98%,插入片段平均长度约为1 kb.通过对大鲵皮肤cDNA文库的随机筛选,分离获得了大鲵肌动蛋白相关2/3复合物亚基-5样蛋白(Arp2/3 complex subunit 5-like,Arpc5l)基因cDNA序列.生物信息学分析表明,大鲵Arpc5l基因全长cDNA为699 bp,包含459 bp的开放阅读框,分子量为17 154.36,等电点(pI)为5.43;该基因编码的Arpc5l蛋白分别在7-29 AA处和44-66 AA处具有跨膜结构域及多种二级结构,且三级结构与Arp2/3 complex家族成员相似.实时定量PCR结果表明,该基因在大鲵皮肤、肌肉、肠、肝、脾、肺、胃以及肾等组织中广泛表达,且在肾、肠、肌肉中的表达量极显著高于其它组织(P<0.01).进化分析结果表明,大鲵Arpc5l氨基酸序列和小鼠(77%)等陆生动物同源性最高,和爪蟾同源性为73%,大鲵处于水生到陆生之间的过渡类型,且与陆生动物的亲缘关系更近.

家蝇Actin-5 C基因启动子的生物信息学分析及载体构建

目的运用生物信息学分析家蝇(Musca domestica L.)肌动蛋白5 C(Actin-5 C)基因,构建Actin-5 C启动子双荧光素酶报告基因表达载体。方法使用伯克利果蝇基因组计划(BDGP)在线分析软件、Promoter 2.0和在线比对启动子网站(FPROM)等多种启动子预测工具,分析、预测家蝇肌动蛋白Actin-5 C基因5′端上游非编码区,根据预测结果构建截短式启动子萤火虫荧光素酶报告基因重组质粒,转染草地贪夜蛾卵巢细胞系sf9细胞,并使用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行萤火虫荧光素酶报告基因的检测。结果Actin-5 C基因5′端上游的-2609~-94 bp,预测有启动活性,且分值达0.8分以上,其中-2198~-2148 bp分值最高、达0.98分;在-220 bp和-1444 bp处分别检测到CAAT和TATA盒信号,经比较取最有可能的1156 bp(-1236~-80 bp)、1745 bp(-1825~-80 bp)及2059 bp(-2139~-80 bp)截断启动子片段,构建pGL 3-1156、pGL 3-1745及pGL 3-2059质粒,RT-PCR检测到3种重组质粒中的萤火虫荧光素酶报告基因转录成功。结论生物信息学预测工具研究家蝇Actin-5 C基因启动子可以简化认知基因的过程,根据预测结果构建了家蝇Actin-5 C基因萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。

潮湿环境下大鼠脾组织差异蛋白组学研究

目的:通过比较正常及潮湿环境下大鼠脾组织蛋白质谱,筛选和鉴定与湿邪有关的疾病特异性蛋白,探寻湿邪致病的生物标志物。方法:选取SD大鼠20只随机分为对照组、外湿组,每组10只。造模成功后无菌摘除脾脏,取出脾组织10mg/只,进行双向电泳实验、双向凝胶电泳图象分析,肽质量指纹图谱与电喷雾串联质谱鉴定蛋白质,分析差异蛋白质意义。结果:通过比较正常及潮湿环境下大鼠脾组织差异蛋白质,发现3个有意义的蛋白质:表达上调的有2个:载脂蛋白A-I、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基5;表达下调的有1个:结合珠蛋白。结论:正常及潮湿环境下大鼠脾组织蛋白质存在差异表达,这些差异蛋白质可能是与湿邪致病相关的疾病特异性蛋白。

ARPC5在非小细胞肺癌细胞和组织中的表达及预后意义

目的肌动蛋白相关蛋白2/3复合物5(ARPC5)参与癌细胞侵袭性伪足的形成,促进癌细胞的侵袭和转移。本研究旨在探讨肌动蛋白相关蛋白2/3复合物5(ARPC5)在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞和组织中的表达特征及其与预后的相关性。方法 RT-PCR法及Western blot法检测ARPC5 m RNA及蛋白在肺癌细胞系A549、SK-MES-1、H460、95D及人正常支气管上皮细胞系HBE中的表达。免疫组化SP法检测ARPC5在133例NSCLC和25例癌旁正常组织中的表达情况,应用Kaplan-Meier曲线和Cox风险回归模型分析其与预后之间的关系。结果 ARPC5在NSCLC细胞系的m RNA及蛋白两个水平上的表达均高于正常支气管上皮细胞系。在133例NSCLC组织标本中,ARPC5阳性表达率67.7%,而在22例癌旁正常肺组织中不表达。ARPC5蛋白的表达与TNM分期和淋巴结转移密切相关(<0.01)。单因素生存分析显示ARPC5阴性表达患者5年生存率为57.8%,而阳性患2者为37.5%,差异有统计学意义(χ=8.634,<0.05);但多因素生存分析并未提示其为独立的预后指标。结论ARPC5是一种潜在的癌基因,可能参与肿瘤的转移,其表达影响患者预后但还不能成为判断肺癌预后独立指标。