癌蛋白PRC17与人肌球蛋白调节轻链相互作用的初步鉴定

目的:分析前列腺癌基因17(PRC17)与人肌球蛋白调节轻链(MLC2)之间的相互作用,并鉴定PRC17蛋白序列上与MLC2相互作用的功能区域。方法:经大肠杆菌表达并用Glutathione Sepharose 4B纯化GST及融合蛋白GST-MLC2,用SMMC-7721细胞表达带HA标签的PRC17及其截短突变体HA-PRC17(353)、HA-PRC17(251)、HA-PRC17(164)和HA-PRC17(Δ164),GST沉淀实验分析GST-MLC2与PRC17及其截短体的相互作用。结果:经诱导表达并纯化的GST和GST-MLC2分子质量符合预期,分别约为28.4 kD和46.6 kD,纯度均95%以上;GST沉淀实验结果显示,PRC17结合MLC2,不结合阴性对照GST;PRC17(353)和PRC17(251)也能有效结合MLC2,但PRC17(164)和PRC17(Δ164)都不能与MLC2结合。结论:PRC17能特异性结合MLC2,其蛋白序列上与MLC2结合的部位位于其氨基端251位氨基酸之内,可能在164位氨基酸附近。

细胞骨架蛋白肌球蛋白轻链与癌蛋白TRE17相互作用的鉴定

目的:探讨MLC2与TRE17之间的相互作用。方法:构建了MLC2原核表达质粒,在用pGEX蛋白表达系统表达和纯化GST-MLC2和GST蛋白后,用GST Pulldwon方法进一步观察MLC2与TRE17之间的相互作用。结果:限制性内切酶分析和DNA序列测定表明MLC2 cDNA完整ORF以正确的阅读框架插入pGEX-6P-1载体;IPTG诱导表达的GST-MLC2和GST蛋白纯度在90%以上;GST Pulldown分析表明癌蛋白TRE17(447)结合GST-MLC2融合蛋白,而不是对照GST蛋白。结论:MLC2是TRE17的特异性结合蛋白。

肌球蛋白调节性轻链磷酸化在慢性心力衰竭发生机制中的作用

胚胎时期,肌球蛋白调节性轻链2(myosin regulatory light chain,MYL2)在心脏的发育与功能方面扮演着重要角色。MYL2(也称MLC2)的基因突变与肥厚型心肌病有关。MYL2突变可影响肌球蛋白的结构和功能,导致肥厚型心肌病、扩张型心肌病甚至慢性心力衰竭的发生。同时,MYL2的磷酸化在心肌收缩、心室扭转、心脏功能和疾病方面也发挥着重要作用。

肌球蛋白调节性轻链在慢性心力衰竭大鼠心室肌的表达变化

目的:检测肌球蛋白调节性轻链(MYL2)在慢性心衰大鼠心室肌的表达变化。方法:建立腹主动脉缩窄大鼠慢性心衰模型,采用免疫组化染色和集成光学密度(IOD)定量观测MYL2在心室肌的表达及其表达程度,并与假手术组对照分析。结果:心衰组大鼠左室收缩末压(LVSP)、左室内压上升最大速率(+dp/dtmax)、左室内压下降最大速率(-dp/dtmax)显著低于假手术组,左室舒张末压(LVEDP)显著高于假手术组(P均<0.01)。免疫组化染色示心衰组心室肌MYL2表达显著低于假手术组;心衰组染色标本的平均IOD为(47.12±12.08)×106,假手术组为(97.77±36.21)×106,前者显著低于后者(P<0.01)。结论:心室肌MYL2表达的显著降低可能是慢性心衰发生的重要机制。

肌球蛋白调节性轻链磷酸化在心脏疾病中的研究进展

肌球蛋白调节性轻链可通过磷酸化调节心肌收缩、肥大、程序性细胞死亡、纤维化和扭转,从而影响心脏功能。虽然肌球蛋白调节性轻链磷酸化的功能和作用机制并不完全清楚,但磷酸化的异常与心脏疾病具有明显相关性。现就肌球蛋白调节性轻链磷酸化的主要功能、作用机制及其在心脏疾病中的研究进展进行综述,为心脏疾病的研究、治疗奠定基础和提供理论依据。

核肌球蛋白轻链在心肌缺血/再灌注中的作用机制

目的：探讨核肌球蛋白调节轻链（NMLC20）在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及其对NOX2的表达机制.方法建立SD大鼠心肌缺血/再灌注或心肌细胞低氧/复氧损伤模型,并用ML7或基因沉默等进行干预.检测心肌梗死损伤,NOX2mRNA和蛋白表达水平以及胞质、胞核MLC20蛋白和磷酸化水平等指标.利用免疫共沉淀、DNApull-down和荧光素报告酶基因等评估MLC20对NOX2的表达调节机制.结果IR处理后,大鼠心肌损伤增加伴随NOX2表达和p-NMLC20水平升高,胞质p-MLC20水平降低.上述现象能被ML-7逆转;HR处理后,心肌细胞凋亡增加伴随NOX2表达和p-NMLC20水平升高,胞质p-MLC20水平降低,上述现象可被ML-7或MLC20siRNA逆转;免疫共沉淀等结果显示p-NMLC20能与RNApolII形成复合物,通过结合NOX2基因启动子区域特定序列促进NOX2表达.结论心肌缺血/再灌注时,核肌球蛋白通过其调节轻链磷酸化,与RNA聚合酶II形成转录起始复合物,进而识别结合NOX2基因启动子特定序列促进NOX2表达.

日本血吸虫肌球蛋白调节轻链的原核克隆表达及虫期转录特异性

目的在原核系统中克隆表达日本血吸虫肌球蛋白调节轻链(SjMRLC)并分析其基因的虫期转录特异性。方法根据SjMRLC的核苷酸序列(GenBank登录号为AY815219)设计特异性引物,PCR扩增目的基因,并克隆入原核表达载体pGEX4T-3;转至大肠埃希菌BL21株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;蛋白质印迹分析(Western blotting)鉴定表达产物;提取日本血吸虫各虫期总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增分析SjMRLC基因的虫期转录特异性。结果构建pGEX 4T-3/SjMRLC重组质粒,测序表明插入的外源基因片段正确,诱导表达获得带有GST标签的可溶性蛋白(Mr49000);虫期转录特异性分析显示该基因在日本血吸虫各个虫期均有转录,且水平一致。结论成功获得可溶性的带有GST标签的SjMRLC;SjMRLC是管家基因。

肌球蛋白轻链在肺动脉高压内皮祖细胞衰老中的作用机制

目的探讨非肌肉型肌球蛋白调节轻链（nmMLC20）在肺动脉高压内皮祖细胞（EPCs）衰老中的作用及机制.方法建立低氧诱导的肺动脉高压动物模型和体外EPC衰老模型,采用法舒地尔或基因沉默等进行干预.测定大鼠右心室收缩压（RVSP）,右心重构指数,肺血管重构,外周血EPCs衰老率,EPCs中NOX2mRNA和蛋白表达和p-nmMLC20水平等指标.结果肺动脉高压大鼠外周血来源EPCs衰老率明显增加伴随NOX2表达和p-nmMLC20水平升高.上述现象能被法舒地尔逆转;低氧处理后,EPCs衰老率增加伴随NOX2表达和p-nmMLC20水平升高,上述现象可被法舒地尔或MLC20 siRNA逆转.结论肺动脉高压时,nmMLC20以磷酸化形式促进NOX2表达,提高活性氧水平,进而加速了EPCs衰老.

调节轻链在平滑肌肌球蛋白分子上的定位

应用凝胶电泳覆盖技术和放射自显影法研究了32~P-标记的平滑肌肌球蛋白调节轻链在肌球蛋白分子上的定位。实验结果表明调节轻链(LC_(20))可重新结合于平滑肌肌球蛋白重链(200kD),重酶解肌球蛋白(130kD)及其62kD和26kD肽段上。这提示调节轻链的结合点位于平滑肌肌球蛋白亚段-1羧基端的26kD肽段上。

肌球蛋白轻链激酶在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚中的作用及机制

目的探讨肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)在血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)诱导心肌肥大中的作用及机制。方法原代培养的乳鼠心肌细胞分成3组:对照组、AngⅡ组和AngⅡ+MLCK抑制剂(ML-7)组(AngⅡ+ML-7组)。免疫荧光染色计算心肌细胞横截面积;定量反转录聚合酶链反应(quan-titative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测心肌肥大标志物[心房利尿钠肽(atrial di-uretic natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)]mRNA含量;Western blotting检测心肌细胞MLCK、肌球蛋白调节性轻链(regulatory myosin lightchain,MLC2)、磷酸化MLC2(P-MLC2)以及凋亡标志物(Bax、Bcl-2与caspase-3)蛋白表达。结果与对照组组相比,AngⅡ组心肌细胞横截面积、肥大标志物m RNA表达、促凋亡因子Bax以及caspase-3蛋白表达显著增加,且抗凋亡的Bcl-2表达含量降低,并伴随MLCK、P-MLC2蛋白表达降低。给予MLCK抑制剂ML-7处理后,与AngⅡ组相比,心肌肥大、凋亡指标均进一步增加,而MLCK、P-MLC2蛋白表达含量显著下调(总MLC2表达无明显变化)。结论抑制MLCK可能加剧Ang Ⅱ诱导的心肌肥厚及凋亡,其机制与抑制MLCK/MLC2通路密切相关。

小鼠肌球蛋白轻链激酶生物信息学分析

目的利用生物信息学方法探讨小鼠肌球蛋白轻链激酶(MYLK)的结构、编码蛋白质的结构及功能等,为研究MYLK蛋白功能调节机制奠定基础。方法通过生物信息学分析,对MYLK基因编码的产物及理化性质、信号肽、跨膜结构、二级结构、三级结构、结构域、亚细胞定位、磷酸化及互相作用蛋白等进行预测分析。结果MYLK由1950个氨基酸组成,为理论等电点为5.92的亲水性不稳定蛋白,无信号肽和跨膜区域,二级结构主要为无规则卷曲,成功构建其三级结构,MYLK蛋白有四种结构域,主要存在于细胞核,有较多的Thr、Ser磷酸化位点,Tyr磷酸化位点相对较少,与MYLK相互作用的蛋白主要是肌球蛋白和钙调蛋白。结论MYLK是具有核定位、无跨膜结构、亲水性不稳定的蛋白质,在细胞黏附、迁移、凋亡等生理活动中具有极为重要的意义。

胰岛素对糖尿病大鼠动脉壁肌球蛋白轻链激酶表达的影响

目的探讨胰岛素是否通过细胞外信号调节激酶(ERK)通路调控糖尿病模型大鼠动脉壁肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达。方法 SD大鼠45只,随机分为正常对照组、高脂对照组、糖尿病组、胰岛素治疗组,通过腹腔注射链尿佐菌素(STZ)复制糖尿病大鼠模型,心脏取血检测血清学指标,采用免疫组化法和Western blot法分析大鼠动脉壁MLCK的表达以及肌球蛋白轻链(MLC)、ERK表达及其磷酸化水平。结果正常对照组动脉壁中MLCK的表达处于较低水平,高脂对照组表达略有升高,而糖尿病组MLCK表达较正常对照组和高脂对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),胰岛素治疗可以显著降低糖尿病造成的MLCK表达的升高(P<0.05);并且MLC、ERK的磷酸化水平与MLCK表达呈一致性。结论糖尿病进程中可能通过ERK通路上调动脉壁MLCK的表达而导致血管损伤,而胰岛素治疗可以下调动脉壁MLCK的高表达。

沉默肌球蛋白轻链9基因对非小细胞肺癌H1299细胞株增殖及迁移的影响

目的探讨沉默肌球蛋白调节轻链9(MYL9)基因对非小细胞肺癌H1299细胞株增殖及迁移的影响。方法将H1299细胞株分为对照组(CON组)、阴性对照组(NC组)和敲减组(KD组),CON组细胞不进行转染,NC组、KD组分别转染空载短发夹RNA慢病毒和沉默MYL9基因表达的短发夹RNA慢病毒。检测3组细胞MYL9 mRNA表达水平、增殖能力及迁移能力。结果与CON组和NC组比较,KD组MYL9的mRNA相对表达水平、细胞增殖及细胞迁移能力均更低(均P <0. 05)。结论沉默MYL9基因可下调非小细胞肺癌H1299细胞株MYL9基因的mRNA表达水平,降低其增殖和迁移能力。

肌球蛋白监管轻链基因在非小细胞肺癌研究新进展

20KD人类肌球蛋白监管轻链基因（MYL9）,位于人类染色体20q11.23上,由其表达的肌球蛋白监管轻链是肌球蛋白的重要组成部分。肌球蛋白轻链激酶（MLCK）等多种调节因子通过调节MYL9的磷酸化和去磷酸化使得肌球蛋白参与了几乎所有细胞生理病理过程,如细胞迁移、黏附、胞质分裂、囊泡转移、细胞吞饮和基因转录等。最新研究表明MYL9基因在非小细胞肺癌癌细胞的增殖、

肌球蛋白轻链磷酸化为心脏适应应激所必不可少

背景 回应于循环或神经内分泌的应激，心脏加强收缩，心肌肥厚。若应激持续，这种增殖的回应可能发展而为失代偿的心力衰竭（简称心衰）。造成这一改变的机制大多尚未明了。基于心脏肌球蛋白轻链2（MLC2V）在head—rodjunction与肌动蛋白结合，使肌动蛋白一肌球蛋白相互作用而强化收缩，作者提出下述假设：MLC2V磷酸化参与心脏对应激的适应。作者先前曾确认cardiac—MLCK（cMLCK）在心肌细胞的MLC2V去磷酸化中起主要作用，但它在调节疾病和健康心脏功能中的作用尚待明确。

肌动球蛋白磷酸化对其解离的影响

目的:研究改变肌动球蛋白粗提物磷酸化水平对其解离程度及ATPase活性的调控作用。方法:以肌动球蛋白粗提物为材料,添加蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)改变蛋白的磷酸化水平(4℃孵育48 h),通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光染色、蛋白质免疫印迹、ATPase活力测定试剂盒测定蛋白的磷酸化水平、游离肌动球蛋白含量和肌动球蛋白ATPase活力随孵育时间的变化。结果:PKA处理组蛋白样品中的肌钙蛋白T和肌球蛋白调节轻链的磷酸化水平显著高于对照组(P<0.05),游离肌动蛋白含量显著高于对照组,且在0~2 h显著升高,2~48 h缓慢升高;肌动球蛋白ATPase活力显著低于对照组(P<0.05),其活力随孵育时间延长显著升高(P<0.05);AP处理组的变化则与之相反。结论:肌钙蛋白T、肌球蛋白调节轻链的磷酸化降低了肌球蛋白与肌动蛋白之间的相互作用力(肌动球蛋白ATPase活力低),从而促进肌动球蛋白的解离。

肌球蛋白轻链激酶介导的肌球蛋白调节轻链磷酸化研究

肌球蛋白轻链激酶(MLCK)是一种Ca2+/CaM(钙调素)依赖性蛋白激酶,通过介导肌球蛋白调节轻链(RLC)磷酸化促进肌肉的收缩。近年来研究发现RLC磷酸化在细胞病理生理功能中起着重要作用,本文就MLCK介导的RLC磷酸化最新研究进展作一综述。

平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制

在平滑肌收缩活动中 ,肌球蛋白轻链激酶 (MLCK)对肌球蛋白轻链 (MLC2 0 )的钙依赖性磷酸化是引起平滑肌收缩的主要原因 ,同时还存在着其它非钙依赖性的调节途径。高浓度的MLCK和Ca2 + independentLC2 0kinase均可引起MLC2 0 的非钙依赖性磷酸化 ;Rho kinase、花生四烯酸及蛋白激酶C等都能抑制肌球蛋白轻链磷酸酶的活性 ,减少MLC2 0 的脱磷酸化 ;调宁蛋白、原肌球蛋白和钙介导蛋白等能通过与肌动蛋白或肌球蛋白的结合来调节肌球蛋白Mg2 + ATP酶活性。这些因素都有助于维持低Ca2 + 时平滑肌的张力。

肌纤生成调节因子-1促肌节F-actin组装引起新生乳大鼠心肌细胞肥大

目的探索肌纤生成调节因子-1(myofibrillogenesis regulator-1,MR-1)通过调节肌原纤维生成引起心肌肥大的机制。方法干预MR-1在体外培养的新生乳大鼠心肌细胞中的表达,检测心肌细胞表面积、心房利钠因子和脑钠肽水平及蛋白合成速率3种心肌肥大指标的变化,以鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素标志并观察肌节F-actin组装,以半定量反转录-聚合酶链反应、免疫印迹和细胞免疫荧光术检测重要肌节分子myomesin-1、肌球蛋白调节轻链-2(myosin light chain-2,MLC-2)含量及亚细胞定位。结果 MR-1过表达引起心肌细胞肥大、肌节F-actin组装明显促进、MLC-2与myomesin-1表达上调(P<0.05)以及myomesin-1的细胞核-细胞质转位;MR-1沉默后小泛素样调节因子-1过表达引起的转位和肌节F-actin组装明显抑制。结论 MR-1通过促进myomesin-1和MLC-2调节肌原纤维生成引起心肌细胞肥大。