平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP酶活性的调节

肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6·5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段(F6·5和F6·5/D),经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段(F6·5)使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.

橙皮苷分别与小檗碱、辛弗林合用对肌球蛋白活性的调节特征

为探讨小檗碱与橙皮苷合用以及辛弗林与橙皮苷合用对平滑肌肌球蛋白活性的调节的特征。在肌动蛋白存在与不存在两种实验条件下,研究发现:(1)小檗碱和辛弗林可抑制磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATPase活性,橙皮苷可增加磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATPase活性;(2)小檗碱与橙皮苷合用、辛弗林与橙皮苷合用均对磷酸化的肌球蛋白Mg2+ATPase活性具有双向调节作用,即对部分磷酸化的肌球蛋白起兴奋作用,对完全磷酸化的肌球蛋白起抑制作用。这种双向调节方式对平滑肌功能失调可能具有有价值的调节作用。

小檗碱对平滑肌肌球蛋白功能及胃肠平滑肌收缩性的影响

目的:探讨小檗碱对平滑肌肌球蛋白功能及胃肠平滑肌收缩性的影响。方法:以平滑肌肌球蛋白Mg2+-ATPase活性、肌球蛋白磷酸化以及胃与肠道平滑肌的收缩振幅为指标,考察小檗碱对平滑肌肌球蛋白Mg2+-ATPase活性和肌球蛋白磷酸化程度的影响,及其对离体小肠与胃平滑肌条收缩性的影响。结果:(1)在肌球蛋白轻链的Ca2+依赖性磷酸化反应中,小檗碱能抑制磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATPase活性;(2)在肌球蛋白轻链的Ca2+依赖性磷酸化反应中,小檗碱可显著抑制磷酸化肌球蛋白轻链磷酸化程度;(3)小檗碱对大鼠离体小肠及胃平滑肌条收缩性均具有抑制作用。且均呈剂量依赖性。结论:小檗碱可通过抑制平滑肌肌球蛋白的功能,抑制胃肠道平滑肌的收缩性。