SphK1/S1P/S1PR2信号通路促进肌生成:运动改善骨骼肌健康的新视角

背景:近年来,运动改善骨骼肌的健康已成为学者们关注的一个重要研究内容,适宜的运动对骨骼肌具有积极的作用,其中在运动激活鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1,SphK1)/鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)/鞘氨醇-1-磷酸受体2(sphingosine-1-phosphate receptor2,S1PR2)信号通路如何改善骨骼肌的健康,正受到科研人员的重视。目的:研究运动经SphK1/S1P/S1PR2信号通路如何改善骨骼肌的健康,探索治疗相关肌肉疾病的新方法,以改善人的骨骼肌健康。方法:检索Web of Science、PubMed、中国知网、万方和维普数据库从建库至今与文章主题相关的文献,以“signaling pathway,SphK1,S1P,S1PR2,skeletal muscle,satellite cell,myogenesis,exercise”为英文检索词,以“信号通路,SphK1,S1P,S1PR2,骨骼肌,卫星细胞,肌生成,运动”为中文检索词,最终纳入69篇文献进行分析。结果与结论:①SphK1/S1P/S1PR2信号通路是一个复杂的调控网络,通过SphK1催化产生的S1P,与S1PR2等受体的相互作用,触发下游信号转导过程,进而调控细胞、组织、器官和系统的多种生物学功能。②SphK1/S1P/S1PR2信号通路能调控卫星细胞增殖和成肌细胞分化,改善肌生成。③文章通过文献资料调研法分析了SphK1/S1P/S1PR2信号通路的生理基础以及运动对其影响的可能性。急性有氧运动可提高骨骼肌中SphK1的表达,人体和动物研究中已证实急性和长期运动均可提高骨骼肌中S1P水平,另外研究表明长期抗阻运动可提高S1PR2在骨骼肌中的表达,部分实验结果表明急性和长期运动对肌肉或者血液中S1P水平无显著影响,出现不同结果的原因可能是选择的研究对象、方式、强度及频率不同,而具体机制尚不明确。④研究认为,运动能够促进SphK1/S1P/S1PR2信号通路在骨骼肌中的表达,调控下游相关信号通路,并且针对这一信号通路的研究可能为骨骼肌疾病的治疗提供新的策略和方法,从而改善骨骼肌健康。⑤未来应深化对SphK1/S1P/S1PR2信号通路与骨骼肌健康关联的研究,进一步揭示其与卫星细胞、成肌细胞的调控关系及与上下游通路的相互作用,挖掘其临床应用价值,制定康复方案时考虑该通路变化,探索不同运动对该通路的影响机制,并将其作为潜在治疗靶点,结合人体肌肉模型提升研究深度和准确性。

运动促进骨骼肌健康的新视角:基于Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路改善肌生成和糖代谢的研究进展与展望

骨骼肌是维持机体运动能力、调节机体能量代谢的重要器官,其内分泌功能也日益被重视。久坐、衰老、肥胖等因素会引起肌萎缩,继而影响糖脂代谢稳态,引起内分泌失调等相关疾病。抑制Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路能干预癌变,而激活该通路可控制骨骼肌生成、调节机体糖代谢。通过文献资料调研法分析了Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路的生理基础以及运动对其影响的可能性,系统阐述了运动调控Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路改善肌生成和糖代谢的潜在机制。研究认为,运动可通过Rac1/PAK1/p38 MAPK信号通路促进生肌决定因子的形成和葡萄糖转运蛋白4转位,从而促进骨骼肌再生,改善骨骼肌对葡萄糖的摄取能力。

2型糖尿病并发视网膜病变患者血清皮质醇、肌生成抑制素、SCUBE-1水平变化及临床意义

目的探讨2型糖尿病(T2DM)并发糖尿病视网膜病变(DR)患者血清皮质醇、肌生成抑制素(Mstn)、信号肽-补体蛋白C1r/C1s、Uegf和Bmp1-表皮生长因子结构域包含蛋白1(SCUBE-1)的水平变化,并分析其与增生型DR的关系。方法将2018年3月至2021年12月北京中医医院怀柔医院眼科收治的T2DM并发DR患者365例纳入研究,根据有无新生血管分为增生型DR组(62例)和非增生型DR组(303例)。将同期北京中医医院怀柔医院内分泌科收治的单纯T2DM患者51例纳入研究作为T2DM组。另外,选取同期于北京中医医院怀柔医院体检健康者51例作为健康对照组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清皮质醇、Mstn和SCUBE-1水平,同时收集纳入研究者基线资料,采用Pearson相关分析血清皮质醇、Mstn、SCUBE-1与基线资料中各指标的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清皮质醇、Mstn、SCUBE-1对增生型DR的诊断价值。结果血清皮质醇、Mstn、SCUBE-1水平的组间比较显示,增生型DR组均高于非增生型DR组,非增生型DR组均高于T2DM组,T2DM组均高于健康对照组(P<0.05)。单因素分析显示,增生型DR组体重指数(BMI)、空腹糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血清葡萄糖(FSG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、甘油三酯(TG)、血尿素(Urea)、血肌酐(Cr)、尿清蛋白排泄率(UAER)高于非增生型DR组(P<0.05)。Pearson相关分析显示,T2DM并发DR患者血清皮质醇、Mstn、SCUBE-1水平与BMI、糖尿病病程、HbA1c、FSG、FINS、HOMA-IR、TG、Urea、Cr、UAER均呈正相关(P<0.05)。血清皮质醇、Mstn、SCUBE-1、两两联合(皮质醇+Mstn、皮质醇+SCUBE-1、Mstn+SCUBE-1)及3项指标联合检测诊断增生型DR的ROC曲线下面积分别为0.695、0.747、0.742、0.768、0.758、0.771、0.838,3项联合应用的诊断效能较高。结论T2DM并发DR患者血清皮质醇、Mstn、SCUBE-1水平异常升高,与增生型DR有关,3项指标联合检测对增生型DR具有较高的诊断价值。

猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定

根据文献报道的猪肌生成抑制素基因 c DNA序列 ,分别从第 1、第 2和第 3外显子中设计引物 ,以大约克猪染色体 DNA为模板 ,分段扩增出含内含子和外显子的序列。将所得各序列回收、克隆到 p GEM-easy T载体中 ,然后进行序列测定。合并所有测得的猪肌生成抑制素基因序列 ,共获得 6 kb连续序列。分析结果表明 ,猪肌生成抑制素基因第 1内含子长 1 80 9bp,第 2外显子长 374 bp,第 2内含子长 1 978bp。所测得的外显子序列与已发表的 c DNA序列同源分析比较 ,没有出现引起氨基酸改变的突变。表明瘦肉型猪 (大约克猪 )肌生成抑制素基因仍很完整 。

生肌调节因子及肌生成调控因素研究进展

生肌调节因子(myogenic regulatory factors,MRFs)是调控肌肉生成的重要基因,家族中包括MyoD、MyoG、Myf5和Myf6。MyoD能把多种类型细胞转化为成肌细胞,在肌肉特异基因转录调控中起着总开关作用;MyoG的表达能够控制成肌细胞融合的起始,促使成肌细胞增殖;Myf5协同MyoD在肌肉形成过程中发挥作用,而Myf6与MyoG共同控制肌肉分化。研究表明,MRFs家族基因的表达与肉用动物的产肉性能和肉质性状密切相关,遗传、营养和环境等因素对该家族基因的表达水平有显著影响。作者综述了MRFs家族的结构与功能、基因表达与活性调节以及营养、光照、温度、运动和活性物质等因素对该家族成员基因活性和肌生成的调控作用,以期为建立动物肌肉发育调控技术奠定理论基础。

猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA的克隆

从猪的肌生成抑制素 ( MSTN)编码序列中设计引物 ,以军牧一号猪肌细胞总 RNA为模板 ,利用 RT-PCR和嵌套 PCR技术 ,扩增出 MSTN c DNA片段。该片段全长 1 2 77bp,包含猪 MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与 p MD1 8-T载体连接 ,转化到 JM1 0 9大肠杆菌中 ,成功地筛选到阳性克隆 ,其质粒测序结果与文献报道的一致。经 Eco R 和 Pst 酶解分析 ,c DNA片段与 p MD1 8-T载体之间既有正向插入的克隆 ,也有反向插入的克隆 ,所得到的 MSTN c

猪肌生成抑制素C端88氨基酸肽抗体制备

用IPTG诱导pET 28α MSTN BL21工程菌产生猪肌生成抑制素下游包涵体,应用SDS-PAGE侧带法纯化包涵体蛋白,并用EDCI进行直接偶联,皮下多点注射试验用獭兔,连续免疫3次,每次间隔2周,其间用ELISA跟踪检测抗体效价。6周后,心脏采血,获得高效价的抗血清,血清滴度达1∶6400。

朗德鹅肌生成抑制素基因组织分布研究

采用PCR和测序的方法检测肌生成抑制素基因在朗德鹅组织中的分布情况,研究结果表明,肌生成抑制素基因在大脑、小脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、腹脂、皮下脂肪、骨骼肌中均有表达。肌生成抑制素基因在组织中广泛分布说明了其功能的重要性。

猪肌生成抑制素组织分布研究

利用经纯化、偶联后的猪肌生成抑制素包涵体获得的高效价猪肌生成抑制素 (MSTN)抗血清进行免疫组织化学实验 ,结果表明 :MSTN在肺脏、肝脏、小脑、胰脏、心脏和脂肪细胞中呈现重度染色 ,说明MSTN在这些组织细胞中均有分布。而在肌肉、肾脏、子宫细胞中出现轻微染色 ,这说明MSTN在这些组织细胞中分布较弱 (2 0 0倍光镜 ) 。

猪肌生成抑制素基因编码序列的分析

通过PCR分段扩增出军牧 1号白猪的肌生成抑制素基因编码序列 112 8bp ,与国外猪种同一基因的cDNA序列进行比较 ,仅在 634bp处发生了由T替换C的变化 ,但对应的氨基酸没有变化。

猪各组织器官内肌生成抑制素基因mRNA表达谱的研究

用Trizol试剂法提取军牧一号猪的骨骼肌、心肌、肝、肾、肺、脾、胰、脂肪的总RNA做RT-PCR和嵌套PCR,结果在军牧一号猪骨骼肌、心肌和脂肪组织内检测到了肌生成抑制素mRNA的表达,而在其他组织中未检测到。

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素基因myostatin(MSTN)的cDNA在去除信号肽后,对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆,并测序分析,结果表明其与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamH 和Sal 内切酶识别序列的另1对引物进行PCR扩增,将回收的1.2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建的表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,表达的MSTN分子质量为41.4513ku。因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92.5%。

猪肌生成抑制素(MSTN)基因cDNA克隆及序列分析

利用GenBank中猪肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以湖北白猪背最长肌肌细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出MSTN基因cDNA片段。该片段全长1277bp,包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pUCm-T载体连接,转化到DH5α大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道的一致。

猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中的表达

将猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列真核表达质粒,采用脂质体法转染COS-7细胞,经RT-PCR检测,转染重组质粒的COS-7细胞MSTN mRNA呈阳性,表明该重组体能够在真核细胞中完成转录过程。SDS-PAGE电泳结果有43 ku目的蛋白表达带,并用Western blotting证实了其表达的特异性,表明猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列可以在真核细胞中表达。

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。

猪肌生成抑制素C-端功能区蛋白的分离纯化

为研究猪肌生成抑制素(myostatin,MSTN)蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,将原核表达菌种MSTN-PGEX-4T-1-BL21进行融合表达,用亲和层析的方法对GST-MSTN和MSTN C-端成熟蛋白进行分离纯化。12%SDS-PAGE结果表明,纯化后的GST-MSTN在38 kD得到清晰目的带,薄层扫描分析显示,目的蛋白质纯度达86.1%。每升菌液提取约4.5 mg融合蛋白。15%SDS-PAGE结果表明,MSTN C-端成熟蛋白功能区在12 kD有明显条带出现。每升菌液提出约1.3 mg MSNT C-端成熟蛋白,占融合蛋白表达量的29%。

军曹鱼肌生成抑制素基因的克隆与序列分析

肌生成抑制素(Myostation,MSTN)是一种骨骼肌生长的负调控因子,其生物功能主要是抑制骨骼肌的生长。肌生成抑制素的活性降低或丧失,可使肌肉与其他组织的比例大大提高,因此在动物育种和医疗上有很大的潜在应用价值。目前包括鱼类在内的20多种脊椎动物的MSTN cDNA已经得到克隆和测序。本实验依据已知的鱼MSTN cDNA的保守区域设计一对特异引物,利用PCR技术分别从军曹鱼基因组中扩增出一个约1000bp的特异片段和300bp片段,所得目的片段回收纯化,将其酶切产物连接到pMDl8-T克隆载体上,转化入JM109感受态细胞中,挑取阳性克隆进行转化子鉴定,其质粒测序结果与文献报道的一致,证明成功地克隆了军曹鱼肌生成抑制素基因。

猪肌生成抑制素下游编码基因的合成及其克隆

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段,F_1、F_2、F_3、R_6、R_5、R_4、F_4、F_5、F_6、R_3、R_2和R_1,采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F_1长38bp,R_1长36bp,其他片段均40bp长,F_1和R_1片段两端分别加上限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段。该片段与pMDI8-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致。表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素(myostatin,MSTN)基因的cDNA去除信号肽后PCR扩增出成熟蛋白编码序列1.2kb片段熏将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞;筛选阳性克隆测序分析,结果表明与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamHI和SalI内切酶识别序列的另一对引物进行PCR扩增,将回收的1.2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了编码猪肌生成抑制素成熟蛋白的原核表达载体。LB液体培养基中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示重组菌表达的MSTN蛋白以包涵体形式存在;经薄层扫描仪扫描分析SDS-PAGE凝胶,表达的MST包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,其相对分子质量为41451.3。所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签HisTrap亲和柱纯化后纯度可达92.5%。该试验为获得较好的猪肌生成抑制素并制备抗体打下了良好的基础。

肌生成抑制素基因研究进展

肌生成抑制素是 1 997年发现的骨骼肌生长发育负调控因子 ,肌生成抑制素不仅在骨骼肌中表达 ,还可在心肌和浦肯野纤维等多种组织中表达。研究表明 ,大鼠骨骼肌在体内的再生 ,对 MSTN m RNA的表达表现出明显的时间依赖性 ,并且 m RNA的表达不必由功能性神经支配。通过对不同品种双肌表型牛 MSTN基因的研究 ,发现其骨胳肌增大的共同特点是肌生成抑制素基因发生了突变 ,如布鲁牛 MSTN基因在编码区外显子 3发生 1 1 bp的缺失 ,导致MSTN此位点后的阅读框架改变 ,并在此点后的 1 4个密码子处终止了阅读框架 ,从而使MSTN被截短 ,MSTN蛋白活性区域消失 ,活性丧失 ,结果肌肉大量增加。目前 ,已分别对人、牛和猪的 MSTN基因进行了定位研究 ,猪肌生成抑制素基因定位研究表明 ,猪 MSTN基因位于1 5号染色体上。