肌肉生成抑制素(MSTN)基因及其在畜牧业上的应用

肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)是控制肌肉生长的负调控因子,属于TGF-β超家族成员,是影响畜禽瘦肉率、改善肉质性状的重要营养基因。文章主要对MSTN基因的结构、基因表达、生物学功能及其在畜禽生产中的应用进行综述。

猪肌生成抑制素(MSTN)基因cDNA克隆及序列分析

利用GenBank中猪肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以湖北白猪背最长肌肌细胞总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出MSTN基因cDNA片段。该片段全长1277bp,包含猪MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与pUCm-T载体连接,转化到DH5α大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道的一致。

猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定

根据文献报道的猪肌生成抑制素基因 c DNA序列 ,分别从第 1、第 2和第 3外显子中设计引物 ,以大约克猪染色体 DNA为模板 ,分段扩增出含内含子和外显子的序列。将所得各序列回收、克隆到 p GEM-easy T载体中 ,然后进行序列测定。合并所有测得的猪肌生成抑制素基因序列 ,共获得 6 kb连续序列。分析结果表明 ,猪肌生成抑制素基因第 1内含子长 1 80 9bp,第 2外显子长 374 bp,第 2内含子长 1 978bp。所测得的外显子序列与已发表的 c DNA序列同源分析比较 ,没有出现引起氨基酸改变的突变。表明瘦肉型猪 (大约克猪 )肌生成抑制素基因仍很完整 。

牛肌肉生长抑制素(MSTN)基因的检测、分型研究

本研究根据皮埃蒙特牛肌肉生长抑制素 (MSTN)基因序列设计了 3条特异性引物 ,以纯种皮埃蒙特牛、皮荷杂种牛和荷斯坦牛的 DNA为模板 ,对是否携带 MSTN基因的个体牛进行单核苷酸多态性分析 。

猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA的克隆

从猪的肌生成抑制素 ( MSTN)编码序列中设计引物 ,以军牧一号猪肌细胞总 RNA为模板 ,利用 RT-PCR和嵌套 PCR技术 ,扩增出 MSTN c DNA片段。该片段全长 1 2 77bp,包含猪 MSTN基因的全部编码序列。将所得片段与 p MD1 8-T载体连接 ,转化到 JM1 0 9大肠杆菌中 ,成功地筛选到阳性克隆 ,其质粒测序结果与文献报道的一致。经 Eco R 和 Pst 酶解分析 ,c DNA片段与 p MD1 8-T载体之间既有正向插入的克隆 ,也有反向插入的克隆 ,所得到的 MSTN c

猪肌生成抑制素基因编码序列的分析

通过PCR分段扩增出军牧 1号白猪的肌生成抑制素基因编码序列 112 8bp ,与国外猪种同一基因的cDNA序列进行比较 ,仅在 634bp处发生了由T替换C的变化 ,但对应的氨基酸没有变化。

猪各组织器官内肌生成抑制素基因mRNA表达谱的研究

用Trizol试剂法提取军牧一号猪的骨骼肌、心肌、肝、肾、肺、脾、胰、脂肪的总RNA做RT-PCR和嵌套PCR,结果在军牧一号猪骨骼肌、心肌和脂肪组织内检测到了肌生成抑制素mRNA的表达,而在其他组织中未检测到。

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素基因myostatin(MSTN)的cDNA在去除信号肽后,对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆,并测序分析,结果表明其与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamH 和Sal 内切酶识别序列的另1对引物进行PCR扩增,将回收的1.2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建的表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,表达的MSTN分子质量为41.4513ku。因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92.5%。

军曹鱼肌生成抑制素基因的克隆与序列分析

肌生成抑制素(Myostation,MSTN)是一种骨骼肌生长的负调控因子,其生物功能主要是抑制骨骼肌的生长。肌生成抑制素的活性降低或丧失,可使肌肉与其他组织的比例大大提高,因此在动物育种和医疗上有很大的潜在应用价值。目前包括鱼类在内的20多种脊椎动物的MSTN cDNA已经得到克隆和测序。本实验依据已知的鱼MSTN cDNA的保守区域设计一对特异引物,利用PCR技术分别从军曹鱼基因组中扩增出一个约1000bp的特异片段和300bp片段,所得目的片段回收纯化,将其酶切产物连接到pMDl8-T克隆载体上,转化入JM109感受态细胞中,挑取阳性克隆进行转化子鉴定,其质粒测序结果与文献报道的一致,证明成功地克隆了军曹鱼肌生成抑制素基因。

猪肌生成抑制素下游编码基因的合成及其克隆

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段,F_1、F_2、F_3、R_6、R_5、R_4、F_4、F_5、F_6、R_3、R_2和R_1,采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F_1长38bp,R_1长36bp,其他片段均40bp长,F_1和R_1片段两端分别加上限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段。该片段与pMDI8-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致。表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素(myostatin,MSTN)基因的cDNA去除信号肽后PCR扩增出成熟蛋白编码序列1.2kb片段熏将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞;筛选阳性克隆测序分析,结果表明与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamHI和SalI内切酶识别序列的另一对引物进行PCR扩增,将回收的1.2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了编码猪肌生成抑制素成熟蛋白的原核表达载体。LB液体培养基中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示重组菌表达的MSTN蛋白以包涵体形式存在;经薄层扫描仪扫描分析SDS-PAGE凝胶,表达的MST包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27.9%,其相对分子质量为41451.3。所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签HisTrap亲和柱纯化后纯度可达92.5%。该试验为获得较好的猪肌生成抑制素并制备抗体打下了良好的基础。

肌生成抑制素(MSTN)的研究进展

本文较全面地介绍了肌生成抑制素的发现历程、基因特点、表达与调控、作用机理以及与脂肪积累、肌肉消长等研究的进展情况,并对肌生成抑制素在畜牧业、医学上的应用作了介绍。

肌生成抑制素基因研究进展

肌生成抑制素是 1 997年发现的骨骼肌生长发育负调控因子 ,肌生成抑制素不仅在骨骼肌中表达 ,还可在心肌和浦肯野纤维等多种组织中表达。研究表明 ,大鼠骨骼肌在体内的再生 ,对 MSTN m RNA的表达表现出明显的时间依赖性 ,并且 m RNA的表达不必由功能性神经支配。通过对不同品种双肌表型牛 MSTN基因的研究 ,发现其骨胳肌增大的共同特点是肌生成抑制素基因发生了突变 ,如布鲁牛 MSTN基因在编码区外显子 3发生 1 1 bp的缺失 ,导致MSTN此位点后的阅读框架改变 ,并在此点后的 1 4个密码子处终止了阅读框架 ,从而使MSTN被截短 ,MSTN蛋白活性区域消失 ,活性丧失 ,结果肌肉大量增加。目前 ,已分别对人、牛和猪的 MSTN基因进行了定位研究 ,猪肌生成抑制素基因定位研究表明 ,猪 MSTN基因位于1 5号染色体上。

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素 (MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体 ,并对mRNA进行转录水平的检测 ,为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后 ,用PCR扩增的 1.2kb目的片段与 pMD18 T载体连接 ,将克隆载体的质粒DNA与同样用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶解的表达载体 pET2 8a(+ )质粒定向连接 ,对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录 ,对mRNANorthern杂交进行转录水平的检测。结果 ,所得到的序列与所设计的序列完全一致 ,表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选 ;目的片段定向插入 ,阅读框架正确 ;RT PCR成功地反转录得到约 1.2kb的目的DNA片段 ,Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影 ,见到清晰的 1.

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素基因myostatin(MSTN)的cDNA去除信号肽后对成熟蛋白编码序列PCR扩增出1.2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109受体菌细胞,筛选阳性克隆测序分析,结果表明与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamHI和SalI内切酶识别序列的另一对引物进行PCR扩增,将回收的1 2kbPCR目的片段定向克隆到pET28a(+)表达载体上,成功地构建了猪肌生成抑制素成熟蛋白编码的原核表达载体。对成功构建表达载体阳性克隆在LB液体培养基中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组菌表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的;SDS-PAGE凝胶经薄层扫描仪扫描分析,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27 9%,表达的MSTN分子量为41451 3D.因为所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,则用His-trap亲和柱进行纯化后,纯度可达92 5%.该试验为获得较好的猪肌生成抑制素基因抗原、制备抗体打下了良好的基础。

牛肌生成抑制素基因全序列的克隆及原核表达

根据GenBank上发表的牛肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,利用RT-PCR技术,以牛肌细胞总RNA为模板,对牛的肌生成抑制素(MSTN)基因编码序列进行扩增。经酶切鉴定、DNA测序和氨基酸序列分析证实MSTN基因克隆成功。从pMD18T-MSTN克隆中获得MSTN编码序列,将其与pET32a(+)质粒连接,构建pET32a(+)-MSTN重组质粒,重组菌经IPTG诱导在大肠杆菌中表达的MSTN蛋白是以包涵体的形式表达的,SDS-PAGE特异区带分子量为60ku。

家畜肌生成抑制素基因的研究进展

肌生成抑制素基因(myostatin,MSTN)活性的降低或丧失所出现的"双肌"动物,给畜牧业生产带来了显著的经济效益,因此,许多畜牧学者探讨如何利用MSTN来提高动物的生产力。本文对肉用大型家畜牛、猪、绵羊、山羊MSTN基因国内外研究进展及应用前景进行了综述,为家畜MSTN基因的进一步研究提供一定的理论参考。

猪肌生成抑制素C端88氨基酸肽抗体制备

用IPTG诱导pET 28α MSTN BL21工程菌产生猪肌生成抑制素下游包涵体,应用SDS-PAGE侧带法纯化包涵体蛋白,并用EDCI进行直接偶联,皮下多点注射试验用獭兔,连续免疫3次,每次间隔2周,其间用ELISA跟踪检测抗体效价。6周后,心脏采血,获得高效价的抗血清,血清滴度达1∶6400。