在非洲爪蟾卵母细胞上表达大鼠肌肉乙酰胆碱受体的方法学研究

目的 :建立适合于研究肌肉松驰药作用的乙酰胆碱受体的实验模型。方法 :采用磁珠技术从大鼠肌肉中提取多聚腺嘌呤mRNA ,注入去膜的非洲爪蟾卵母细胞 ,表达为有功能的离子通道 ,并与未去膜和去膜未注射的卵母细胞比较 ,利用电压钳方法记录电压依赖性的离子通道电流 ,观察并分析三组电流特性。结果 :三组卵母细胞的静息膜电位和钳制到 - 6 0mV时的补偿电流之间无显著的统计学意义 ,通过去除卵母细胞的卵泡膜可以去除内源性受体的干扰 ,在注射大鼠肌肉mRNA的卵母细胞膜上记录到典型的N2 型ACh受体的电流。结论 :本实验建立的模型可作为在细胞和蛋白水平研究肌松药的方法。

人肌肉乙酰胆碱受体的初步纯化及其生物学鉴定

目的 :从人肌肉中提取具有免疫活性的乙酰胆碱受体蛋白 ,为复制MG动物模型提供抗原。方法 :新鲜股四头肌制成匀浆后 ,采用TritonX - 1 0 0提取 ,以SephadexG - 1 50柱凝胶层析 ,初步纯化 ;然后采用紫外分光光度法及SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,检测蛋白的含量和纯度 ;应用主动免疫的方法 ,检测AchR的免疫学特性。结果 :此纯化物的蛋白含量为 3 .2mg/ml;SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,呈一条 44kD的主要蛋白带 ;此纯化物成功地复制出了MG动物模型。结论 :该方法提取的乙酰胆碱受体蛋白 ,具有免疫活性 。

肌肉型乙酰胆碱受体在HEK293细胞上的表达

目的 利用受体克隆技术 ,建立骨骼肌细胞乙酰胆碱受体 (m nAChR)的实验模型 ,以便进行各种药理研究。方法 应用分子生物学技术将编码小鼠m nAChR的α、β、γ、δ、ε亚基之cDNA分别重组于真核细胞表达质粒pcDNA3 1+ 上 ,用脂质体转染技术 ,将重组后的pcDNA3 1+ 导入HEK2 93细胞 ,使其细胞膜上表达胚胎型乙酰胆碱受体 (γ nAChR)和成年型乙酰胆碱受体 (ε nAChR) ,这样建立了两种m nAChR亚型的实验模型。应用全细胞膜片钳技术测量转染细胞对该受体的内生配基乙酰胆碱的反应。结果 乙酰胆碱可激发转染细胞产生一内向电流 ,电流的大小与乙酰胆碱呈浓度依赖性。结论 HEK2 93细胞在转染后 2 4～ 72h内 ,其细胞膜上表达γ nAChR或ε nAChR ,用于进行各种药理实验。

作用于肌肉型乙酰胆碱受体的生物毒素研究进展

目的近几十年,肌肉型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)成为神经生理学、药理学、药物设计及相关疾病研究的重要靶点。包括横纹肌肉瘤、小儿软组织瘤、肌源性紊乱等疾病都与肌肉型nAChRs的异常有关。因此寻找针对肌肉型nAChRs的特异性探针,对于研究受体的结构、功能及相关疾病发病机理与治疗药物研发至关重要。方法通过查阅相关文献对近年来发现的特异作用于肌肉型nAChRs的生物毒素进行了综述。结果与结论自然界中存在许多天然生物毒素,能特异作用于肌肉型nAChRs,这些毒素对于研究肌肉型nAChRs的结构和功能,以及相关疾病的诊断和治疗有着非常重要的应用价值。

α-芋螺毒素MIA和MIB特异性阻断肌肉型乙酰胆碱受体研究

α-芋螺毒素是从海洋软体动物芋螺毒液中发现的多肽类毒素,能够特异作用于各种不同亚型烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs在调节神经递质释放、细胞兴奋性等方面发挥重要生理功能。因为nAChRs功能异常与多种疾病密切相关,所以α-芋螺毒素可以开发为研究nAChRs的分子探针或直接作为先导药物进行开发。前期,研究人员从幻芋螺中发现的4种α-3/5型芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,但MIA和MIB对不同亚型的nAChRs阻断活性及选择性还没有深入研究,本研究通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相法合成了α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,并利用电生理技术对它们抑制不同亚型鼠源nAChRs的活性进行系统测定,结果表明MIA和MIB是肌肉型乙酰胆碱受体拮抗剂,半阻断剂量(IC_(50))分别是14.45和72.78 nmol·L^(-1),稍弱于MI与MIC,且对其他神经型nAChRs阻断活性微弱。分子对接研究显示, MIA和MIB与肌肉型nAChRs作用机制类似, N-端氨基酸序列差异是其活性差异的主要原因。本研究表明,芋螺毒素MIA和MIB有潜力发展成为检测肌肉型nAChRs功能以及诊断或治疗相关疾病的工具药物。

肌肉型乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

建立肌肉型乙酰胆碱受体(胎儿型α1β1δγ和成年型α1β1δε)在非洲爪蟾卵母细胞中的表达模型,用于以这两种受体为靶点的药物筛选。将肌肉型乙酰胆碱受体的各个亚基基因在体外转录获得各自的cRNA,显微注射到非洲爪蟾卵母细胞中,利用双电极电压钳技术检测其表达情况,并确定不同浓度的乙酰胆碱对胎儿型α1β1δγ和成年型α1β1δε受体电流表达情况的影响。在卵母细胞中成功表达两种肌肉型乙酰胆碱受体;当乙酰胆碱浓度为1μmol/L时,α1β1δγ和α1β1δε受体电流很小,不能用于后续的检测试验,当浓度为5μmol/L时,完全激活α1β1δγ受体的开放电流达到最大6025 nA,当浓度为20μmol/L时,完全激活α1β1δε受体的开放电流达到最大2 742 nA,只注射ddH2O的对照组细胞则没有任何电流产生。该受体模型的成功建立,为筛选作用于肌肉型乙酰胆碱受体的药物提供了实验模型。