利用生物信息学方法对人类(Homo sapiens)肌肉增强因子2(MEF2)的特性比较及进化分析

肌肉增强因子2(Myocyte enhancer factor 2,MEF2)是MADS(MCM1,agamous,deficiens和serum response factor)家族成员之一,在动物发育过程中起到重要的调节作用。为了进一步了解其调控的复杂性,本文根据NCBI中已有的人类MEF2相关数据,应用ExPASy在线序列分析工具、CBS在线分析服务器软件、Conserved Domain Database(CDD)数据库、SABLE在线分析软件等对人类MEF2蛋白的不同亚型序列进行比较分析,同时,根据相关序列的比对结果构建系统进化树进行分析。结果表明,MEF2在人体内以多种蛋白形式存在,其理化性质存在一定差别,可能的翻译后糖基化修饰多为O型糖基化且均存在较多磷酸化位点。人类各MEF2蛋白具明显MADS结构域,多数具有MEF2结构域和HJURP_C结构域。各MEF2蛋白二级结构均包括了螺旋、折叠和无规则卷曲等多种形式,其三级结构模式相似。系统进化树显示MEF2B蛋白与其他蛋白有着较大的序列差异及较远进化关系,可能较为原始。

MSTN敲除对肌肉增强因子2(MEF2C)和miR-222表达调控的影响

为脂肪沉积转录调控通路的研究奠定基础,通过生物信息学、Western印迹和RT-qPCR等方法研究肌肉抑制素(MSTN)敲除后对潜在调控脂肪沉积的肌肉增强因子2(MEF2C)和miR-222的表达调控作用。结果表明,在miR-222启动子区域预测到MEF2C的结合位点,Western印迹显示肌肉抑制素敲除后MEF2C表达量上调,qPCR结果表明当MEF2C高表达后miR-222表达量上调3.48倍(P<0.01)。说明MSTN敲除后引起MEF2C高表达,进而促使miR-222表达量上升。

含有SAP结构域的肌肉增强因子2激活基因对肝细胞癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制

目的探讨含有SAP结构域的肌肉增强因子2激活基因(MAMSTR)对肝细胞癌(HCC)预后的影响,以及对HCC细胞增殖和凋亡的作用和可能机制。方法从TCGA数据库中获取369例HCC患者肿瘤组织和正常肝组织mRNA数据和相应临床信息。通过Wilcoxon检验分析MAMSTR基因在HCC组织和正常肝组织中的表达差异。通过Kaplan-Meier曲线和Cox回归模型分析MAMSTR与HCC患者预后的关系。应用基因功能富集分析(GSEA)检测MAMSTR在HCC中的潜在生物学功能。使用慢病毒包装质粒构建可诱导表达MAMSTR siRNA的HepG2肝癌细胞系。通过细胞计数、克隆形成和Caspase 3活性实验检测体外条件下MAMSTR对HCC细胞生长和凋亡的作用。使用蛋白质印迹、定量PCR实验分析MAMSTR影响HCC细胞凋亡的分子机制。通过转录因子分析MAMSTR对HCC生物学功能调控的可能信号通路。结果与正常肝组织比较,MAMSTR基因在HCC组织中高表达,P<0.001;且其表达量与年龄和临床分期有关联,均P<0.05。生存分析显示,高表达MAMSTR组患者中位生存期较短,χ^(2)=14.257,P<0.001。单因素(HR=1.302,95%CI为1.160~1.461)和多因素Cox回归模型(HR=1.265,95%CI为1.124~1.424)表明,MAMSTR可以作为HCC患者预后的独立危险因子,均P<0.001。单样本基因集富集分析(ssGSEA)分析发现,MAMSTR高表达组中CD56dim自然杀伤细胞(W=536,P=0.018)、效应记忆CD8+T细胞(W=576,P=0.048)、嗜酸性粒细胞(W=305,P<0.001)、1型辅助性调节T细胞(W=497,P=0.006)和17型辅助性调节T细胞(W=439,P<0.001)抗肿瘤免疫细胞出现下调。同时,促肿瘤免疫细胞记忆B细胞(W=1010,P=0.022)和2型辅助性调节T细胞(W=1191,P<0.001)上调。GSEA结果显示,MAMSTR可能调控E2F转录因子[标准化富集分数(NES)=2.475,P<0.001]、PI3K/Akt/mTOR(NES=1.438,P=0.002)等信号通路。定量PCR检测发现,敲低组细胞MAMSTR的相对表达量(0.624±0.006)明显低于对照组(1.000±0.010),差异有统计学意义,t=45.998,P<0.001。生长计数和克隆形成实验发现,敲低MAMSTR表达可以抑制HepG2细胞生长,t=11.372,P=0.008。Caspase 3活性实验结果显示,Dox(+)组细胞中Caspase 3相对活性(2.209±0.027)明显高于Dox(-)组(1.000±0.017),差异有统计学意义,t=66.576,P<0.001。蛋白质印迹实验验证了在敲低MAMSTR表达的HepG2细胞中,PUMA蛋白在Dox(+)组(1.390±0.018)中相对于Dox(-)组(0.988±0.030)表达上调,差异有统计学意义,t=16.270,P=0.004;BCL2蛋白在Dox(+)组(0.565±0.005)相比Dox(-)组(1.046±0.038)表达下调,差异有统计学意义,t=17.635,P=0.003。定量PCR实验显示,BAX基因在Dox(+)组中相对表达量(1.415±0.055)明显高于Dox(-)组(1.000±0.020),差异有统计学意义,t=9.969,P=0.010。转录因子分析表明,MAMSTR可能通过E2F1参与调控细胞生长,相关E2F1蛋白转录结合域包括cisbp_M3134、transfac_pro_M00920和transfac_public_M00516等。进一步分析发现,E2F1与MAMSTR表达呈正相关,r=0.566,P<0.001。结论MAMSTR基因是促进HCC进展和导致HCC患者预后不良的可能因素之一,其可能通过调节E2F1转录因子网络进而调控HCC细胞增殖和凋亡。

肌肉增强子因子2对猪肌肉生长抑制素启动子活性的调节

肌肉生长抑制素(Myostatin,Mstn)是转化生长因子-β超家族的成员,在哺乳动物的骨骼肌生长和分化过程中起负调控作用,其转录调控受到多个基因的影响,其中肌肉增强子因子2(MEF2)是重要的调控因子之一。因此,对猪Mstn启动子上MEF2位点及其作用方式的探讨具有重要意义。首先,通过PCR方法扩增了猪Mstn基因上游1 969 kb的启动子序列,利用生物信息学方法分析该序列包含3个MEF2的结合位点;其次,采用逐步删除的方法获得5个长度不等的启动子,用荧光素酶报告系统评估了它们在小鼠成肌细胞C2C12中的活性。其次,转入含有MEF2结合位点的启动子片段和MEF2C表达载体,可以显著增强启动子活性2～6倍,高表达另一亚型MEF2A则启动子活性没有明显改变。最后,转入MEF2C表达载体,用实时定量PCR和Western blotting方法检测Mstn的转录和蛋白水平的变化,结果发现mRNA升高了2～4倍;在肌管细胞中,蛋白翻译水平也有显著升高。这些结果显示,MEF2C可以通过激活Mstn参与猪肌肉生长和发育阶段的调节。研究为Mstn基因的转录调控提供了有效的作用靶点和效应分子,为进一步探讨Mstn的功能调控提供了一种新的思路。

CDKN2A、CDKN2B、MEF2A、VEGF基因表达与冠状动脉粥样硬化性心脏病发生的相关性

目的比较细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A(CDKN2A)、CDKN2B、肌肉细胞特异性增强因子2A(MEF2A)以及血管内皮生长因子(VEGF)基因表达在冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)患者和健康人之间的表达差异,以期探寻CHD可能的发病机制。方法选取CHD患者154例(CHD组)和健康者123例(正常对照组),留取全部研究对象的血液标本。通过实时定量PCR法检测CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF mRNA的表达;通过ELISA定量检测血清中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF的含量。结果实时定量PCR结果发现,CHD组CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF mRNA表达量分别为0.011 5±0.002 1、0.003 3±0.000 4、0.302 6±0.035 6和0.022 1±0.004 2,均显著低于正常对照组(分别为0.048 4±0.015 6、0.007 1±0.001 2、0.823 0±0.075 1和0.052 7±0.001 3),差异均有统计学意义(均P<0.05)。ELISA检测结果表明,CHD组血清CDKN2A、CDKN2B、MEF2A及VEGF的表达量分别为(121.60±7.96)、(65.07±5.42)、(6.51±0.83)和(19.41±1.62)μg/mL,均显著低于正常对照组[分别为(236.90±29.13)、(155.70±22.52)、(15.96±2.86)和(39.87±4.54)μg/mL],差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 CHD患者血液中有核细胞内CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF mRNA的表达水平以及血清中蛋白的表达水平都显著低于健康人群,提示这4个基因可能直接影响或间接参与CHD的发生、发展。