肌肉特异性表达Cas9示踪同源打靶载体的构建及其在C2C12细胞中的整合

目的本研究拟构建肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体,为成肌细胞分化研究及肌肉特异表达Cas9小鼠模型制作奠定基础。方法人工合成肌肉特异启动子SP,替换PX459载体中的CMV启动子,构建肌肉特异表达Cas9载体;载体在C2C12细胞中的编辑效率由XbaI和T7E1酶切检测;在此基础上通过同源重组引入DsRed红色荧光蛋白构建Cas9示踪载体;将示踪载体的SP-Cas9-DsRed部分连接至Rosa26位点左右同源臂之间,构建肌肉特异表达Cas9示踪重组载体;将该载体与PX459-Rosa26共转染至C2C12细胞并进行嘌呤霉素筛选,观察荧光的表达,同时,提取细胞DNA进行PCR鉴定和测序,检测载体在C2C12细胞中的整合情况。结果酶切鉴定以及对目的片段的测序结果表明,成功构建了肌肉特异表达Cas9载体PX459-Rosa26-SP和肌肉特异同源打靶示踪载体Donor-Cas9-SP-DsRed;XbaI和T7E1酶切实验表明,PX459-Rosa26-SP在C2C12细胞中具有较高的编辑效率;转染后的C2C12细胞出现红色荧光,表明Donor-Cas9-SP-DsRed具有表达活性且在肌肉细胞中特异表达;PCR鉴定和测序结果表明,Donor-Cas9-SP-DsRed在C2C12细胞Rosa26位点成功整合。结论成功构建了肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体Donor-Cas9-SP-DsRed,在为肌肉特异表达Cas9小鼠模型制备提供载体基础的同时,也为肌肉相关基因疾病的研究与基因治疗提供了新的思路。

肌肉特异基因C10orf71参与病理性心肌肥厚

目的转录因子MEF2通过调控肌肉特异表达基因在病理性心肌肥厚的发生发展中发挥重要的作用,但是直到目前,MEF2下游靶基因所知甚少。方法和结果我们使用自主研发的cardiosignalscan对人、小鼠和原鸡的全基因组核心启动子序列进行筛选,发现了111条启动子区含有MEF2保守结合位点的基因。整合EST表达序列数据库后,我们发现C3orf43和C10orf71是两条受MEF2调控同时在肌肉特异表达的新基因。进一步的功能研究表明,C10orf71在病理性心脏肥厚中显著升高1.6倍(P=0.012),提示C10orf71可能参与了病理性心肌肥厚病程。结论 C10orf71是一个新的受MEF2调控的在肌肉特异表达的新基因,并可能参与了病理性心肌肥厚病程。

骨骼肌特异表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因载体的构建与验证

根据猪α-actin基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到α-actin 5'调控序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-AF,小鼠股四头肌注射该重组载体,RT-PCR检测证明其表达有效性。PCR扩增出1 815 bp的特异性片段,DNA测序结果证明该克隆片段与α-actin 5'端调控区序列相比具有很高的一致性,含有肌肉特异性元件;小鼠股四头肌注射重组载体,RT-PCR显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录。

骨骼肌特异表达载体的构建与验证

目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性。方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT-PCR检测证明其表达有效性。结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT-PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录。结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础。