肌肉生长抑制素前肽融合蛋白的重组表达及其抗萎缩活性的初步鉴定

目的:探讨"白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽"融合蛋白在抗肌萎缩中的作用。方法:首先将肌肉生长抑制素前肽基因第76位天冬氨酸对应的碱基突变为丙氨酸对应的碱基,获得了"突变型肌肉生长抑制素前肽"基因。再将该基因与大鼠白蛋白基因片段连接,克隆至酵母表达载体。利用酵母表达系统,重组表达"白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽"融合蛋白。纯化的重组蛋白用于尾悬吊大鼠的治疗实验。结果:大鼠经过21天的尾悬吊,后肢骨骼肌发生了明显的萎缩。注射"白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽"融合蛋白的尾悬吊大鼠,其后肢骨骼肌未发生萎缩。结论:重组表达的"白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽"

肌肉生长抑制素前肽基因转染对C2C12成肌细胞糖代谢的影响

目的探讨肌肉生长抑制素前肽（myostatin propeptide，MPRO）对C2C12成肌细胞葡萄糖摄取、氧化及糖原合成的影响及其作用机制。方法诱导成熟的C2C12成肌细胞分为对照组、胰岛素组、绿色荧光蛋白（GFP）组、胰岛素＋GFP组、MPRO组及胰岛素＋MPRO组，经相应处理后应用2-脱氧-右旋-[1-^14C]葡萄糖检测MPRO对C2C12细胞葡萄糖摄取、氧化及糖原合成的影响，应用Western印迹法检测胰岛素信号通路活性。结果与对照组相比，胰岛素组及胰岛素＋GFP组葡萄糖摄取及糖原合成量明显增加（P〈0．05）；胰岛素＋MPRO组C2C12细胞葡萄糖摄取量及糖原合成较胰岛素组显著增加（P〈0．05）；但MPRO及胰岛素对葡萄糖的氧化无明显影响（P〉0．05）。Western印迹结果显示，与对照组相比，胰岛素组及胰岛素＋GFP组胰岛素信号通路中的信号分子胰岛素受体β（IRβ）、胰岛素受体底物1（IRS-1）、蛋白激酶B（Akt）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）磷酸化水平及磷脂酰肌醇3激酶（P13K）、细胞膜葡萄糖转运体4（Glut4）的表达显著增高（P〈0．05），转染MPRO后上述基因的蛋白磷酸化和表达水平升高更显著（P〈0．05）。结论MPRO在C2C12可能通过激活IRS-1／P13K／Akt信号通路增加胰岛素刺激的葡萄糖摄取及糖原合成。

肌肉生长抑制素前肽基因干预对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂代谢的影响

目的 探讨肌肉生长抑制素前肽（MPRO）基因对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂代谢的影响及其分子机制.方法 60只雄性C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分为4组（每组15只）：正常对照组（NC组）,高脂饮食组（HF组）,高脂饮食＋绿色荧光蛋白组（HF＋ GFP组）及高脂饮食＋MPRO组（HF＋ MPRO组）.高脂饮食诱导肥胖小鼠模型,以重组腺相关病毒（rAAV）为载体介导MPRO基因或对照基因GFP在小鼠体内表达,观察并检测小鼠体重、皮下及内脏脂肪、血及肝脏甘油三酯水平的变化.Western印迹法检测肝脏AMP活化蛋白激酶α（AMPKα）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、肉碱棕榈酰基转移酶-1（CPT-1）的表达情况.结果 HF组体重、皮下及内脏脂肪、血及肝脏甘油三酯水平较NC组显著升高（t=9.033 ～ 35.459,P均＜0.05）,HF＋ MPRO组体重、皮下及内脏脂肪、血及肝脏甘油三酯水平较HF组显著降低（t=5.233～21.500,P均＜0.05）.Western印迹法显示HF组肝脏AMPKα、ACC磷酸化水平及CPT-1的表达较NC组显著降低（t=16.630～ 23.671,P均＜0.05）;HF＋ MPRO组肝脏AMPKα、ACC磷酸化水平、CPT-1的表达较HF组显著升高（t=8.143 ～ 10.314,P均＜0.05）.结论 MPRO基因可能通过激活AMPK通路,明显改善肥胖小鼠的脂代谢紊乱。

大黄鱼肌肉生长抑制素-1前肽原核表达、多克隆抗体制备和功能验证

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)在动物肌肉的生长和发育过程中起着重要作用。该研究通过RT-PCR从大黄鱼(Larimichthys crocea)肌肉组织中克隆肌肉生长抑制素-1前肽基因(MSTN-1pros),构建了表达大黄鱼生长抑制素前肽的重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,获得了大黄鱼MSTN-1pros融合蛋白。用分离的重组蛋白免疫大白兔,制备了抗大黄鱼MSTN-1pros的多克隆抗体。经蛋白免疫印迹法检测,确定获得的抗体具有较高的特异性。通过对大黄鱼幼鱼的注射实验,发现注射过MSTN-1pros抗体的大黄鱼增重率比对照组降低了20.71%(P<0.05),证明MSTN前肽抗体对大黄鱼的生长具有抑制作用。实验结果表明,MSTN前肽蛋白可以用于养殖鱼类的生长调控。

响应重力负荷变化的抗肌萎缩表达载体构建

目的:为了验证‘肌肉生长抑制素’启动子(PM)对去负荷(失重)的响应能力,观察PM调控下的抗萎缩蛋白(mM)表达载体在肌细胞去负荷时的表达水平及抗萎缩活性。方法:首先,构建了PM调控下的荧光素酶表达载体(pGL3-PM-Luc),检测模拟失重下荧光素酶基因在肌细胞中的表达水平,验证PM对重力负荷变化的响应。随后,构建了PM调控下的mM表达载体‘pGL3-PM-mM’,观察模拟失重下mM在肌细胞中的表达及其对肌细胞增殖的影响。结果:模拟失重下,‘pGL3-PM-Luc’转染的肌细胞荧光素酶表达提高了29%,‘pGL3-PM-mM’载体转染的肌细胞,mM表达上调了2.6倍,细胞增殖活性提高了24%。结论:PM在失重条件下可开启下游基因的表达,依此特点构建的mM表达载体,其mM的表达能随负荷减少而增加,且可促进肌细胞的增殖活性。