凡纳滨对虾肌质钙结合蛋白纯化鉴定、理化特性及抗原表位分析

以凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)为原料,分离纯化和鉴定过敏原肌质钙结合蛋白(sarcoplasmiccalcium-binding protein,SCP),对其理化性质(免疫活性、热稳定性、pH值稳定性及消化稳定性)、二级结构和抗原表位进行研究。结果表明:采用蛋白粗提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析等步骤纯化得到的蛋白分子质量为21.6 kDa,经鉴定,该蛋白为凡纳滨对虾SCP,肽段覆盖率达93.26%。凡纳滨对虾SCP具有较强的免疫活性,在热处理温度≥65℃和强酸强碱条件下免疫活性减弱;SCP对肠液消化具有较强的稳定性,而对胃液消化稳定性较差。凡纳滨对虾SCP的二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲的相对含量分别为26%、16.9%、17.5%、39.6%。利用生物信息学工具结合免疫学技术最终预测识别出8条凡纳滨对虾SCP抗原表位。

过敏原肌质钙结合蛋白在毕赤酵母中的表达、优化及免疫反应性研究

目的 利用毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)高效表达三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)重要过敏原肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein, SCP),并检验其免疫反应性。方法 根据毕赤酵母的密码子偏好性优化SCP基因并构建重组质粒。将其热激转化至P. pastorisGS115菌株后经遗传霉素(geneticin,G418)筛选获得阳性高拷贝子。最后通过甲醇诱导表达重组SCP并结合免疫印记(western blotting,WB)和间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)验证其免疫反应性。结果 在摇瓶水平下,重组SCP在毕赤酵母中最佳的表达条件为:诱导温度为28℃,甲醇添加量为每24h添加1.0%甲醇,诱导pH为6.0,诱导时间为144 h。在此条件下, SCP(纯度为91.6%)的得率为1.5 mg/100 mL菌液,实现了可溶性高效表达。WB和间接ELISA结果表明,重组SCP具有免疫球蛋白G结合能力。结论 毕赤酵母表达系统可以得到纯度较高且免疫反应性良好的重组SCP。本研究可为SCP的理化研究及过敏原标准物质的应用奠定基础,并有望促进特异性甲壳类过敏原检测的发展。

肌质网钙泵SERCA基因在中华绒螯蟹钙离子调控中的功能及其对蜕壳的影响

中华绒螯蟹的蜕壳周期中具有高度复杂的钙调节机制,本研究探索了水体中不同Ca2+浓度(40、80、160和320 mg/L)对中华绒螯蟹的Ca^(2+)信号转导的影响,并对其中的关键因子肌质网钙泵(SERCA)进行基因干扰以探索其功能。结果显示:①养殖水体高浓度Ca^(2+)可致Y器官和鳃组织中Ca^(2+)信号通路相关基因SERCA、PMCA、RyR和NCX相对表达量上升,眼柄中MIH表达量下降,血淋巴中Ca^(2+)与蜕皮激素水平上升,说明高浓度的Ca^(2+)可促进中华绒螯蟹蜕壳。②利用RNAi技术干扰SERCA基因表达,普通水体和加入320 mg/L Ca^(2+)的水体中中华绒螯蟹Y器官中PMCA和NCX基因表达量上升、RyR基因表达量下降,且细胞内Ca^(2+)浓度上升,表明SERCA基因在中华绒螯蟹维持细胞内Ca^(2+)浓度和细胞内钙稳态机制中发挥重要作用。③长期干扰SERCA基因的表达可延长中华绒螯蟹的蜕壳间隔,且降低增重率与存活率。然而,高钙环境下长期干扰SERCA基因,相对于普通水体,蜕壳间隔缩短,存活率降低。研究表明,SERCA基因可能是通过对Ca^(2+)信号的干扰而影响中华绒螯蟹的蜕壳。本实验将为中华绒螯蟹蜕壳机制的进一步研究提供基础参考。

黑鲷幼鱼同生群内不同增重性能子群间背肌质构和脏器生理的差异

根据黑鲷(Sparus macrocephalus)幼鱼同生群内不同增重性能子群间背肌质构和脏器生理的差异,揭示增重性能与机体代谢和取食运动对策与机制间的相关性,对于精准遴选黑鲷幼鱼优质增殖群体和科学指导黑鲷幼鱼高效集约化养殖具重要现实意义。任选西沪港海区板式网箱养殖的黑鲷同生群幼鱼3000尾,停食暂养1d后,按体质量由大到小依次分为A[体质量(8.2±1.5)g,出现率5%]、B[体质量(5.3±0.9)g,出现率20.6%]、C[体质量(3.8±0.6)g,出现率48.3%]、D[体质量(2.4±0.4)g,出现率21%]、E[体质量(1.7±0.5)g,出现率5.1%]等5个子群。在测量并统计背肌质构和脏器质量比例的基础上,较系统开展了不同增重性能子群间耗氧率、窒息点及鳃组织和内脏相关功能酶活力的差异。结果表明:(1)根据脏器比例性状的聚类特征,可较清晰地区分本研究所涉及的各个子群;(2)背肌质构性状和耗氧率性状中随增重性能增强呈单调增加的仅为耐咀性和日均耗氧率,耗氧昼夜节律除C子群呈昼均≈夜均(P>0.05)外,其余子群均呈夜均>昼均(P<0.05);(3)窒息点水中含氧量随增重性能增强呈阶梯式下降趋势,其中与E子群窒息点水中含氧量具显著差异(P<0.05)的仅为A、B子群,呈E>A≈B;(4)内脏淀粉酶、蛋白酶及AKP、ACP和ATP活力随增重性能增强均呈阶梯式下降趋势,SOD、CAT和POD酶活力均呈阶梯式上升趋势,而脂肪酶和LDH酶活力则均呈先降后升趋势;(5)鳃组织SOD、POD、Na^(+)/K^(+)-ATPase和Ca^(2+)/Mg^(2+)-ATPase酶活力均随增重性能增强呈阶梯式上升趋势,CAT酶活力则呈先降后升趋势。研究结果可为黑鲷生长性能评价体系构建、速生种质发掘和指导速生品种(品系)选择育种提供科学依据。

兰色姆“构架-肌质”理论的延伸思考——兼论小说的“肌质”

兰色姆提出的“构架-肌质”理论引起了文论界的普遍注意。在此之前的俄国形式主义者什克洛夫斯基提出的“陌生化”理论,与“构架-肌质”理论有着内在的一致性。这些主要针对诗歌建立的理论同样也适用于小说。小说的肌质生成,语言“陌生化”是方法之一,但更多地还要依靠渗透着特异性体验的个性化细节描写。

丹参酮对心肌肌质网脂质过氧化过程中脂类自由基的清除作用

应用自旋捕集方法和化学发光方法研究天然抗氧化剂丹参酮（Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ）对心肌肌质网膜脂质过氧化过程中产生的脂类自由基的清除作用。发现在一定的浓度范围内，丹参酮对脂质过氧化有较好的保护作用，在丹参酮浓度大于１ｍｇ／ｍｇ蛋白时，对脂类自由基清除率可达６０％。丹参酮对肌质网膜脂质过氧化的保护机理可能是通过清除脂类自由基而阻断脂质过氧化的链式反应，而不是清除氧自由基而防止脂质过氧化的启动。

稀土对肌质网Ca^（2＋）－ATP酶活性的影响

研究了镧、轧、镱及四种配合物对Ｃａ^（２＋）－ＡＴＰ酶活性的影响．结果表明，低浓度的Ｌａ^（３＋），Ｇｄ^（３＋）和Ｙｂ^（３＋）对肌质网Ｃａ^（２＋）－ＡＴＰ酶有激活作用；随着其浓度的增加，它们对酶活性的抑制程度增大；而Ｌａ^（３＋），Ｇｄ^（３＋）和Ｙｂ^（３＋）对纯化的Ｃａ２^（＋）－ＡＴＰ酶则只有抑制作用；Ｇｄ─Ｎ─乙酰─缬氨酸和Ｙｂ─丙氨酰代丙氨酸配合物对肌质网膜和纯化的Ｃａ^（２＋）－ＡＴＰ酶活性的影响与Ｇｄ^（３＋）及Ｙｂ^（３＋）类似，但其激活程度和抑制程度比Ｇｄ^（３＋）及Ｙｂ^（３＋）小；Ｇｄ─ＤＴＰＡ和Ｙｂ－ＤＴＰＡ对Ｃａ２^（＋）－ＡＴＰ酶活性基本无影响。

拟穴青蟹新型过敏原肌质钙结合蛋白的纯化、鉴定及分子克隆

为进一步认识蟹类的过敏原,采用免疫印迹方法,分析发现甲壳类过敏患者血清能与拟穴青蟹肌浆蛋白中分子质量约为21 kD的蛋白质产生特异的IgE结合反应,结果显示该蛋白可能是蟹类新型过敏原。通过硫酸铵盐析、阴离子交换和凝胶过滤柱层析等方法对21 kD-蛋白进行分离纯化,采用Western blotting和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)确认纯化的21 kD-蛋白为肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein,SCP)。采用SMART-RACE(Switching Mechanism At RNA Termini-Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法获得SCP的cDNA序列,该序列全长986 bp,开放阅读框为579 bp,编码193个氨基酸,其理论分子质量21.94 kD,等电点4.44。拟穴青蟹SCP与甲壳类动物SCP具有较高的同源性,与昆虫SCP的同源性较差;三级结构模拟分析显示,SCP含有5个螺旋-转角-螺旋结构区,即EF-手型结构区,并在其中两个手型结构区形成2个钙离子结合位点;进一步预测得到SCP的4个线性抗原表位和3个构象性抗原表位。

凡纳滨对虾次要过敏原肌质钙结合蛋白的质谱鉴定及免疫交叉反应

目的:质谱鉴定凡纳滨对虾相对分子质量(Mr)为21 000的次要过敏原组分肌质钙结合蛋白(SCP),分析它与其他虾、蟹等甲壳类过敏原的免疫交叉反应,以阐明SCP可作为甲壳类食物过敏原检测、检验及脱敏的标准过敏原物质。方法:运用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定凡纳滨对虾Mr为21000的过敏原组分,利用软件BLAST、ClustalW分析甲壳类食物中该蛋白的氨基酸序列同源性,同时用纯化的21 000过敏原免疫小鼠制备其特异性多克隆抗体,通过该抗体与其他8种甲壳类食物蛋白粗提液的Western blot法结果分析该过敏原的免疫交叉反应。结果:质谱鉴定结果显示,凡纳滨对虾21 000过敏原为肌质钙结合蛋白;氨基酸序列同源性分析显示其与斑节对虾、中国对虾、克氏原螯虾、细趾小龙虾、褐虾的SCP序列一致性为81%～100%;Western blot结果显示,针对SCP的特异性多克隆抗体与凡纳滨对虾、刀额新对虾、斑节对虾、口虾蛄、罗氏沼虾、克氏原螯虾、远海梭子蟹、锈斑鲟、中华绒螯蟹粗提液在SCP对应的21 000左右处均有反应条带。结论:凡纳滨对虾Mr为21 000的次要过敏原为肌质钙结合蛋白,其氨基酸序列与多种甲壳类具有很高的同源性以及较强的免疫交叉反应。

胆红素对急性运动所致肌质网某些功能改变的影响

目的 探讨胆红素对急性运动所致腓肠肌肌质网某些功能改变的影响。方法 将Wistar大鼠随机分为对照组、运动组、运动恢复组、胆红素处理运动组、胆红素处理运动恢复组 ,共5组 ,分别灌胃生理浓度的胆红素或生理盐水 4周 ,游泳 2小时后处死 ,测定有关指标。结果 胆红素可以明显抑制急性运动所致的肌质网 (SR) Ca2 +含量的下降、Ca2 +,Mg2 +- ATP酶活性的上升 ,对胞浆 Mg2 +含量的升高也有一定的抑制作用 ,但对肌质网摄 Ca2 +能力的影响不大。结论 胆红素可在急性运动中保护肌质网的某些功能免于受损。

钆对兔肌质网膜脂与膜蛋白的影响

利用荧光偏振、顺磁共振波谱及圆二色谱研究了轧对肌质网膜脂和膜蛋白的影响。结果表明，Ｇｄ３＋降低肌质网膜脂不同层次的流动性，并使Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶的旋转运动加快，低度的浓Ｇｄ３＋使肌质网膜Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶的α－螺旋含量减少，随着其浓度的增加，则使其α－螺旋含量增加。

缬沙坦对心力衰竭家兔肌质网钙ATP酶表达及功能的影响

目的探讨家兔慢性心力衰竭时心肌肌质网钙ATP酶(SERCA2)表达和功能的改变及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦长期干预的意义。方法 27只家兔随机分为3组,假手术组、心力衰竭组和缬沙坦组各9只。通过超容量负荷联合压力负荷建立家兔心力衰竭模型,于术后7周观察左心室结构、血流动力学的变化及SERCA2的表达和功能的改变。结果与假手术组比较,心力衰竭组左心室质量指数[(1.32±0.06)vs(3.61±0.09)g/kg]、左心室舒张末压[(-0.50±1.05)vs(23.00±2.37)mmHg)]显著升高(P<0.05),左心室短轴缩短率[(37.83±3.58)%vs(17.38±3.13)%]及左室射血分数[(72±5)%vs(38±6)%]明显降低(P<0.05);与心力衰竭组比较,缬沙坦组左心室质量指数和左心室舒张末压显著降低[(2.07±0.14)g/kg;(2.17±0.72)mmHg;P<0.05];左心室短轴缩短率及左室射血分数明显升高[(33.8±2.9)%;(65±4)%;P<0.05]。心力衰竭组SERCA2的表达[(0.69±0.04)vs(1.02±0.02)]和功能[(54.4±7.9)%vs(95.5±2.1)%]显著低于假手术组(P<0.05)。缬沙坦组SERCA2的表达和功能显著高于心力衰竭组[(0.91±0.02);(81.7±4.9)%;P<0.05]。结论缬沙坦长期干预,能够改善心力衰竭心脏舒缩功能,可能与增加SERCA2的表达和提高其功能有关。

雌激素对雌性大鼠颏舌肌肌质网Ca^(2+)-ATPase活性及其基因表达的影响

目的:观察雌激素对雌性大鼠颏舌肌细胞肌质网(sarcoplasmic reticulum,SR)Ca2+-ATPase活性及其基因表达的影响,探索其影响颏舌肌功能的分子生物学机制。方法:将30只成年雌性SD大鼠随机分为对照组(control)、去卵巢组(ovariectomy,OVX)、去卵巢回补激素组(ovariectomy with 17β-estradiol,OVX+E2)。术后6周,处死动物,提取颏舌肌SR。采用定磷法检测颏舌肌SR Ca2+-ATPase活性,荧光定量RT-PCR测定SR Ca2+-ATP酶mRNA表达的变化。结果:OVX组血清雌激素水平及子宫湿重较对照组明显降低(雌二醇P<0.01;子宫湿重P<0.01),而OVX+E2组与对照组相比差别无统计学意义(P>0.05)。OVX组颏舌肌SR Ca2+-ATP酶活性较对照组明显降低(P<0.01);OVX+E2组较OVX组有明显提高(P<0.01)、与对照组相比差别无统计学意义(P>0.05)。OVX组颏舌肌SR Ca2+-ATPase mRNA表达较对照组明显降低(P<0.01);OVX+E2组较OVX组有明显提高(P<0.01)、与正常组相比差别无统计学意义(P>0.05)。结论:成年雌性大鼠雌激素水平的变化可引起颏舌肌SR Ca2+-ATP酶活性及其mRNA表达的变化,雌激素可能通过该途径改变颏舌肌功能.

跨膜Ca^(2+)梯度对肌质网Ca^3+-ATP酶调节的特异性

我们曾报道跨膜Ca^(2+)梯度可通过膜脂影响肌质网Ca^(2+)-ATP 酶的构象和活性。本文就跨膜Ca^(2+)梯度对肌质网Ca^(2+)-ATP 酶的调节是否具有特异性作进一步研究。结果表明这种特异性表现在两方面:一是跨膜Ca^(2+)梯度对肌质网Ca^(2+)-ATP 酶功能的调节不能归结于跨膜Ca^(2+)浓度梯度所导致的膜电位的作用,离子载体FCCP 可消除跨膜电位但并不影响肌质网Ca^(2+)-ATP 酶的活力;二是其它二价金属离子如Sr^(2+)的跨膜梯度对肌质网Ca^(2+)-ATP 酶活力基本无影响。荧光偏振系列探剂n-AS 测定的结果表明跨膜Ca^(2+)与Sr^(2+)梯度对嵌有Ca^(2+)-ATP 酶的脂酶体的中部流动性的影响有较大差异。而Ca^(2+)-ATP 酶的Ca^(2+)结合位点正处于脂双层中部,这进一步提示膜脂参与了跨膜Ca^(2+)梯度对Ca^(2+)-ATP 酶的调节作用。

CPM抑制了由1,4NQ诱导的对骨肌肌质网SR钙通道RyR1的激活效应

利用7 -diethylamino -3 -(4' -maleimidylphenyl) -4 -methylcoumarin(CPM)甲基化钙通道RyR1上的特异敏感性硫醇的方法 ,对由1 ,4 -naphthoquinone(1,4NQ)诱导的双相性作用进行了研究 ,发现CPM能明显阻碍由1 ,4NQ诱导的对RyR1的激活 ,但对由1 ,4NQ产生的抑制没有明显作用。用经CPM预处理过和没有处理过的样品与1 ,4NQ温育后离心清洗 ,发现未经CPM处理的样品经激活和抑制浓度的1 ,4NQ温育后 ,离心清洗不能消除1 ,4NQ对RyR1的激活和抑制。而经CPM处理后的样品 ,在1 ,4NQ的激活浓度和抑制浓度下 ,离心清洗后未能观测到1 ,4NQ诱导的激活态 ,但抑制态仍然明显存在。以上结果说明 ,CPM所识别的特异活性硫醇参与了1 ,4NQ激活作用 :CPM与此硫醇发生甲基化作用 ,因此阻断了1 ,4NQ对RyR1上的激活部位硫醇发生作用 。

质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca^(2+)转运的影响

目的：观察ＤＮＡ与骨骼肌肌质网蛋白结合后对肌质网功能的影响。方法：应用差速离心分离大鼠骨骼肌肌质网，并用４５ＣａＣｌ２作为示踪剂，观察质粒ＤＮＡｐｃＤＮＡ３和ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ对肌质网钙转运功能的影响。结果：两种质粒均可明显增加肌质网Ｃａ２＋摄取，呈明显的量效关系，并且也可促进肌质网钙释放。结论：外源质粒ＤＮＡ可影响肌质网钙转运功能。

亲和层析纯化肌质网Ca^（2＋）－ATP酶

建立了一种亲和层析纯化肌质网Ｃａ￣（２＋）－ＡＴＰ酶的方法．用非离子型去污剂Ｃ＿（１２）Ｅ＿８溶解肌质网，再通过反应红－１２０琼脂糖亲和层析柱使肌质网Ｃａ￣（２＋）－ＡＴＰ酶纯度从粗品中的６５％提高到９９％，并具有较高ＡＴＰ水解活性．经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，为电泳纯．

质粒DNA对大鼠骨骼肌肌质网Ca^(2+)-ATPase活性及ryanodine受体结合反应的影响

目的：观察质粒ＤＮＡ 对离体大鼠骨骼肌肌质网Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ 活性及ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 受体结合反应的影响。方法：参照Ｊｏｎｅｓ 等的方法比色测定肌质网Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ 活性；以３Ｈｒｙａｎｏｄｉｎｅ 作为配基，液闪测定肌质网Ｃａ２＋ 释放通道ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 受体与配体的结合。质粒ＤＮＡ 处理组预先将肌质网蛋白与质粒ＤＮＡ３７ ℃共同孵育３０ ｍｉｎ ，而后再测定肌质网Ｃａ２ ＋ＡＴＰａｓｅ 活性和ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 结合反应。结果：预先用１０、２０ 和３０ μｇ ｐｃＤＮＡ３ 及ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ处理后，肌质网Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ 活性分别较对照组升高４５％ （Ｐ＜ ０．０５） ，６８ ％（ Ｐ＜ ０．０１） 和１０９ ％ （ Ｐ＜ ０．０１） 及１０９ ％ ，１１８％ 和１４５％ （Ｐ值均小于０ ．０１） ；质粒ｐｃＤＮＡ３ 可明显降低ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 受体的亲和力，并使Ｂｍａｘ 增强。结论：质粒ＤＮＡ可能通过增强肌质网Ｃａ２ ＋ＡＴＰａｓｅ 的活性促进肌质网对Ｃａ２ ＋ 的摄入，通过影响ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 受体而调控肌质网Ｃａ２ ＋ 释放。

1.4-Naphthoquinone与兔骨肌肌质网钙通道相互作用表现出的双相特性

利用Ｃａ２＋浓度动态光谱法和［３Ｈ］－ＲｙａｎｏｄｉｎｅＢｉｎｄｉｎｇ法，对具有特异氧化硫醇基团的抗肿瘤剂１，４－Ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ（１，４ＮＱ）与兔骨肌肌质网（ＳＲ）钙通道（ＲｙＲ）的作用机制进行了研究．探讨了氧化态１，４ＮＱ激发载钙ＳＲ囊泡的Ｃａ２＋释放机制，并首次揭示出１，４ＮＱ对ｒｙａｎｏｄｉｎｅｂｉｎｄｉｎｇ的影响具有强烈依赖于浓度和时间的双相特性。实验结果表明，ＲｙＲ蛋白上至少存在两个硫醇调控部位，它们的氧化还原态决定着ＲｙＲ的门控功能。这个结果对ＲｙＲ氧化还原模型是一个新发展。

缺血(氧)鼠心肌肌质网和线粒体内钙离子变化的研究

用液体闪烁计数法测定离体再灌注鼠心肌肌质网(SR)和线粒体(Mit)内^(45)Ca^(2+)放射性强度(cpm),比较能量制剂ATP-氯化镁,活性氧自由基清除剂SOD和钙阻滞剂Verapamil对离体缺血(氧)再灌注鼠心肌细胞SR和Mit钙离子浓度的影响。结果表明,ATP-氯化镁,SOD和Verapamil组SR内^(45)Ca^(2+)的cpm均高于对照组cpm(P<0.01或P<0.05),而Mit内均低于对照组cpm(P<0.01)。此3种药物均能增高离体大鼠心肌细胞内SR^(45)Ca^(2+)和降低Mit^(45)Ca^(2+)积聚,从而保护心肌细胞缺血再灌注损伤。