利用家蚕杆状病毒表达家蚕肌质网型钙离子ATP酶蛋白

肌质网型钙离子ATP酶(Sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,Serca)负责将细胞中多余的Ca2+转运并存储于内质网中,从而维持细胞内适宜的Ca2+环境。家蚕Serca创造的细胞内及细胞外Ca2+平衡对家蚕正常生命活动的维持具有重要作用。由于Serca分子量较大并具有10次跨膜结构,很难在大肠杆菌表达系统中表达。为了获得具有生物学活性的重组Serca蛋白,利用p Fast Bac Dual载体构建了用于表达egfp和serca的双元杆状病毒表达载体,转染细胞后获得重组病毒,将重组病毒感染细胞后,成功地在细胞中表达了EGFP和Serca。通过荧光观察及Western blotting分析表明,感染后细胞中Serca和EGFP表达模式一致,从感染后48 h开始表达,在感染后96 h表达量最大。对获得的重组蛋白进行酶活分析,发现感染后48 h至120 h的细胞Serca酶活显著提高。表明具有生物学活性的Serca在此系统中成功获得表达,为深入研究Serca蛋白的功能奠定了基础。

抑制SERCA活性减缓萎缩比目鱼肌间断强直收缩张力的下降(英文)

目的确定骨骼肌收缩的舒张时程可作为判断肌质网钙离子ATP酶(SERCA)活性的功能性指标,并探讨SERCA活性对后肢去负荷大鼠萎缩比目鱼肌间断强直收缩张力下降速率的调节作用。方法采用尾部悬吊大鼠模型,游离骨骼肌肌条进行灌流,观测收缩功能的改变。结果与对照组相比,去负荷4周萎缩比目鱼肌肌条在27℃灌流条件下,间断强直收缩的舒张时程(TR75)显著缩短,强直收缩张力快速下降。相反,采用SERCA活性抑制剂环匹阿尼酸(Cyclopiazonic Acid),可延长TR75时程,并恢复强直收缩张力下降速率至对照水平。较低灌流温度(22℃)降低对照大鼠比目鱼肌SERCA活性,同时减缓强直收缩张力的下降;较高温度(35℃)则产生相反的结果。低浓度咖啡因灌流不能改变萎缩比目鱼肌强直收缩下降速率;增加灌流液Ca2+浓度和钙离子载体A23187作用下,减慢强直收缩张力下降速率。结论缩短的TR75与萎缩比目鱼肌SERCA活性增加相关联,TR75可作为表征SERCA活性的功能性指标。适度抑制SERCA活性,可能通过提高肌纤维内Ca2+浓度,减缓强直收缩张力下降速率。

心衰康胶囊对心力衰竭模型大鼠心肌组织SERCA2a、miR-25表达的影响

目的探讨心衰康胶囊治疗心力衰竭的可能作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、地高辛组及心衰康低、中、高剂量组,每组10只。除空白组外,其余各组大鼠使用阿霉素腹腔注射2周建立心力衰竭模型。造模成功后空白组、模型组大鼠给予l ml/(100g·d)纯净水灌胃;地高辛组给予地高辛片0.02 mg/(kg·d)灌胃;心衰康低、中、高剂量组分别给予心衰康胶囊150、300、450 mg/(kg·d)灌胃,各组每日灌胃1次,连续4周。采用超声诊断仪检测心功能指标[包括左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室收缩末期内径(LVESD)];ELISA法检测血浆N末端B型钠尿肽(NT-proBNP)水平;RT-PCR法检测心肌组织肌质网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)、miR-25基因表达;Western blot法检测心肌组织SERCA2a蛋白表达;HE染色观察心肌组织病理变化。结果与空白组比较,模型组大鼠LVEF、LVFS、SERCA2a蛋白及基因表达降低,LVEDD、LVESD、血浆NT-proBNP水平、miR-25基因表达升高(P<0.05或P<0.01),且模型组大鼠心肌组织结构重度异常,肌间质可见胶原纤维明显增生、少量炎症细胞弥散分布,心肌纤维排列紊乱、可见断裂。与模型组比较,心衰康低、中、高剂量组和地高辛组LVEF、LVFS、SERCA2a蛋白及基因表达升高,LVEDD、LVESD、血浆NT-proBNP水平、miR-25基因表达降低(P<0.05或P<0.01),各药物干预组大鼠心肌组织病理损伤均有一定程度改善,且以心衰康高剂量组改善程度最明显。地高辛组在降低血浆NT-proBNP水平方面优于心衰康各剂量组,而心衰康各剂量组随剂量的增加NT-proBNP水平递减(P<0.05或P<0.01)。与心衰康中、高剂量组比较,心衰康低剂量组SERCA2a蛋白及基因表达降低,miR-25基因表达升高(P<0.05);与心衰康高剂量组比较,心衰康中剂量组SERCA2a蛋白及基因表达降低(P<0.05)。结论心衰康胶囊能够改善心力衰竭大鼠的心肌结构及心功能,且以高剂量效果最佳,其作用机制可能与降低miR-25基因表达、升高SERCA2a表达有关。