黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2克隆与表达调控

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是合成棉子糖系列寡糖(RFOs)的关键酶,在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探究GolS2基因在黄瓜应答非生物胁迫中的作用,本研究采用RT-PCR法从黄瓜中克隆了GolS2基因,其开放阅读框长度为981 bp,编码326个氨基酸,植物GolS2蛋白氨基酸序列一致性很高。进化树中,黄瓜GolS2蛋白与拟南芥GolS2和GolS3蛋白聚在同一分支,亲缘关系最近。盐胁迫和低温胁迫处理显著诱导GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达,但低温处理显著抑制GolS2基因在采后黄瓜果实中的表达。对其启动子顺式作用元件的分析结果显示,GolS2基因启动子中含有多个与逆境胁迫响应有关的顺式作用元件。在采后黄瓜果实中沉默HHO2和GRP3基因的表达,显著下调GolS2基因表达,表明这两个基因调控GolS2基因表达。本研究结果明确了GolS2基因在不同类型黄瓜组织中应答非生物胁迫的功能存在差异,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

植物肌醇半乳糖苷合酶的生理功能和调控机制

植物肌醇半乳糖苷合酶(galactinol synthase,GolS)是高等植物棉子糖类寡糖合成途径中的关键酶,为棉子糖系列寡糖提供活化的半乳糖基,调控植物体内棉子糖(raffinose,RFO)系列寡糖的生物合成与积累。编码该酶的基因属于糖基转移酶(glycosyltransferases,GTs)GT8基因家族的亚家族。GolS参与合成的最终产物棉子糖家族低聚糖(raffinose family oligosaccharides,RFOs)是植物中重要的碳水化合物存在形式,在细胞内可溶性强,可作为脱水保护剂;还能发挥稳定膜结构的作用。同时,GolS催化合成的直接产物肌醇半乳糖苷(galactinol)和RFOs都能作为羟基自由基捕获分子参与活性氧的清除。因此,GolS参与的代谢途径在植物碳同化物的贮存与运输、生物和非生物逆境响应、种子的脱水效应等生命过程中均发挥了重要作用。GolS基因结构差异与表达模式不同,导致不同GolS基因参与的生物学功能具有很大的差异。研究植物中不同GolS基因的结构特征,组织特异性表达特性及它们响应不同生长发育阶段、环境变化的表达特性,对了解GolS参与的生物学功能具有重要意义。同时,在分子生物学水平上,深入了解调控植物GolS基因的分子调控机制,为通过遗传工程或分子辅助育种等手段,利用GolS改良农林作物的经济性状提供理论支持。本文针对近年来植物中GolS基因的生理功能和调控机制的研究进行了综述。

葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因VvGolS2-4的克隆及表达特性分析

为了研究葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因家族的特性,以抗低温品种左优红组培苗为材料,通过同源克隆技术,获得VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4全长CDS,对其序列进行了生物信息学分析,同时利用实时定量PCR技术探究了3个基因的组织表达特性和响应逆境因子及相关信号分子的特性。结果显示:3个基因c DNA大小分别为954,978,1 011 bp,分别编码317,325,336个氨基酸序列;3个蛋白分子量分别为36.65,36.97,38.12 k Da;等电点分别为5.12,5.33和5.16,且均在C端含有一个疏水的五肽APXAA;实时荧光定量PCR证明,3个GolSs在葡萄不同组织中表达情况不同,VvGolS2和VvGolS4在叶片中表达量最高,而VvGolS3则在花和卷须中表达量最高;不同逆境因子及逆境信号分子均会影响VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因的表达量,其中VvGolS2和VvGolS4基因的表达受盐诱导最明显,VvGolS3基因的表达受低温诱导最明显;另外,胁迫信号分子乙烯、过氧化氢和脱落酸均可诱导VvGolS2基因表达量上升,而VvGolS3基因的表达受脱落酸和乙烯的诱导,乙烯、过氧化氢和硫化氢则均可诱导VvGolS4基因表达量上升。综上推测,3个Vv GolSs均与葡萄抵御逆境胁迫相关,但各自功能可能有所不同。

烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1。NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近。这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础。

小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证

旨在研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用机制及其相关抗冷基因工程的应用。克隆了小桐子肌醇半乳糖苷合成酶家族成员3基因(Jc GS3)的全长c DNA,序列长1 053 bp,包含完整的开放阅读框1 008 bp,编码由335个氨基酸组成的酶蛋白(理论分子量为38 k D、等电点为5.44,含有典型的Dx D基序)。对其相应基因组序列中启动子区域进行分析,鉴定到了TATA框、CAAT框、CRT/DRE低温响应元件以及ABA应答元件等。进一步将其在酵母中表达,发现该基因的表达能够显著提高其重组酵母菌的低温抵抗能力。

拟南芥中低温诱导肌醇半乳糖苷合成酶基因表达作用初探

研究了拟南芥中肌醇半乳糖苷合成酶基因(AtGol-3)在低温条件下表达量的变化。结果表明,AtGol-3基因受到低温胁迫诱导;并且AtGol-3基因在低温诱导晚期大量表达,这与其上游受到低温诱导相关的DREB/CBF和ABRE等转录因子的调控有关。

芝麻肌醇半乳糖苷合成酶基因SiGolS6的克隆及功能分析

【目的】SiGolS6是芝麻肌醇半乳糖苷合成酶家族成员,在植物抗旱过程中可能发挥重要作用。研究SiGolS6在植物干旱胁迫抗性中的功能,以期为芝麻抗旱遗传改良提供理论基础和基因资源。【方法】利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法从芝麻中克隆获得肌醇半乳糖苷合成酶基因SiGolS6。使用InterProScan、ClustalX2和MEGA5.2等生物信息学软件对序列进行分析。通过对转SiGolS6拟南芥材料的表型分析和生理指标测定,研究SiGolS6在植物抗旱性中的功能及作用机理。【结果】克隆获得SiGolS6的全长CDS序列为921 bp,编码306个氨基酸,其蛋白质分子量为35.07 kD,等电点为4.75。序列分析显示SiGolS6蛋白含有糖基转移酶保守结构域(IPR002495),属于糖基转移酶超家族。与其他物种GolS蛋白构建的系统进化树中,SiGolS6与马铃薯中的同源基因相似度较高。利用潮霉素筛选和PCR鉴定,获得6个独立的转基因拟南芥株系;qRT-PCR分析筛选出表达量较高的3个转基因株系(OE-2、OE-3和OE-4)用于后续试验分析,检测发现这三个转基因株系的棉子糖含量显著高于野生型植株。干旱胁迫下,转基因株系萎蔫程度较野生型轻,干旱胁迫28 d和复水恢复生长5 d后,转基因株系的鲜重均显著高于野生型,而正常供水条件下无明显差异;干旱胁迫28 d后复水生长5 d,50%的转基因植株基本恢复,而野生型植株存活率不到10%。干旱胁迫21 d,转基因植株的相对电导率,活性氧积累和相对MDA含量均显著低于野生型,而相对SOD、POD活性则显著高于野生型。【结论】在拟南芥中超量表达芝麻SiGolS6,能够提高植物在干旱胁迫中的耐受性。

大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS克隆及非生物胁迫表达分析

【目的】本文探索了大豆肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)基因与非生物胁迫的关系。【方法】通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增编码GolS的基因GmGolS。生物信息学分析预测该基因及编码蛋白的理化性质。构建系统进化树分析GolS蛋白的亲缘进化关系。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在非生物胁迫下的表达模式。【结果】GmGolS基因ORF全长987 bp,编码328个氨基酸,分子量38.03 kDa,等电点5.79。GmGolS蛋白定位于细胞的叶绿体和/或细胞质中,并且与沙冬青AmGolS蛋白的亲缘关系最近。干旱、高盐和低温胁迫均可不同程度的诱导GmGolS基因的表达,且GmGolS对干旱胁迫的响应最为明显。【结论】以上结果表明GmGolS基因在大豆中可响应多种非生物胁迫,为GmGolS在大豆抗逆基因工程育种中的进一步应用提供理论依据。

刺齿报春苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因的鉴定及序列分析

肌醇半乳糖苷合成酶基因与植物光合产物运输、种子耐脱水性、抵御生物与非生物胁迫和自我保护等生理生化过程密切相关。基于刺齿报春苣苔(Primulina spinulosa)转录组测序数据,获得(鉴定)1个肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析结果表明,该基因全长1 347 bp(GenBank登录号为MG521418),开放阅读框(ORF)为1 008 bp,共编码335个氨基酸。进一步基于氨基酸序列的分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为38.05 ku,理论等电点为5.09,为亲水性蛋白,含有1个与糖基转移酶家族蛋白相同的保守结构域;刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因与同科的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica,FJ222452)的相似性高达90%,两者在系统进化树上聚为1支。研究结果为进一步研究刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子结构和功能奠定了基础。

两个大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因的原核诱导表达

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉子糖系列寡糖(RFOs)生物合成途径中的关键酶,在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增获得编码GolS的GmGolS2-1和GmGolS2-3基因。添加酶切位点EcoRⅠ和SalⅠ,将GmGolS2-1和GmGolS2-3分别连入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析诱导浓度和诱导时间对蛋白表达的影响。结果表明:在诱导时间为3h,IPTG浓度为0.1mmol·L^-1时,可获得大量GmGolS2-1和GmGolS2-3的重组蛋白,分子量均大约为40kD。

扬州大学发现黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶可通过促进同化物运输提高耐冷性

低温胁迫下,RFOs可在植物体内积累,起到渗透调节、失水保护或抗氧化等作用。RFOs又是黄瓜等葫芦科植物同化物的主要运输形式;因此,RFOs在这类植物的体内具有双重功能。肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是催化RFOs合成的关键酶,可被各种逆境诱导上调,同时也是黄瓜叶片同化物装载的关键酶。在黄瓜叶片中,GolS在低温等逆境胁迫下的变化机制有待探索。

一个辣椒肌醇半乳糖苷合成酶同源基因全长cDNA的克隆与低温表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术,从低温处理的辣椒(Capsicum annuum L.)品种‘苏长红’叶片中克隆得到一个肌醇半乳糖苷合成酶同源基因(GS)的cDNA序列(GenBank登录号:EF566470),全长1444bp,推断其编码336个氨基酸。序列分析表明该基因与其他高等植物的GS基因具有较高的同源性。该基因常温下在辣椒各组织中均无表达,经4℃或10℃处理6h后在叶片中开始表达,而茎和根系中均不表达。Southern杂交结果表明辣椒基因组中还存在其他GS同源基因。

木薯中肌醇半乳糖苷合成酶基因在大肠杆菌中的表达

本研究利用从木薯中克隆到的肌醇半乳糖苷合成酶基因构建到高效表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeGolS5-p GEX,并对GST-MeGolS5融合表达的IPTG诱导浓度、诱导不同温度、不同菌液浓度和诱导时间等条件进行优化。研究结果表明:随诱导时间增长GST-MeGolS5融合蛋白表达量提高,在37℃时,OD600为0.4左右,诱导4 h MeGolS5-GST融合蛋白的表达量达到最大,在0.2 mmol/L IPTG浓度下,可以有效诱导MeGolS5-GST融合蛋白的表达;MeGolS5重组菌株可以耐受5%的PEG6000模拟的干旱胁迫。本研究结果可为解析MeGolS5基因的功能以及在木薯抗旱过程中的作用机理提供参考。

泡核桃肌醇半乳糖苷合成酶基因克隆及表达分析

肌醇半乳糖苷合成酶是植物中棉子糖系列寡糖合成中的关键酶,在植物抗性生理中扮演重要作用。本研究利用RT-PCR技术从泡核桃中成功克隆获得一个受冷害诱导的肌醇半乳糖苷合成酶基因（Js GS1）,其含有1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸,登录号为：KX657831。该基因推断的蛋白与核桃（Juglans regia）GS蛋白的相似性为89%;系统进化树分析显示其与核桃、麻疯树（Jatropha curcas）、蓖麻（Ricinus communis）形成一个分支。半定量PCR显示：低温4℃处理3 h后有微弱表达,6 h后大量表达。这说明Js GS1是典型的受冷害诱导的GS基因。本研究为揭示泡核桃抗寒机理以及肌醇半乳糖苷合成酶在冷害胁迫下的作用提供帮助,并为利用基因工程手段培育抗寒新品种提供理论依据。

油菜(Brassica napus L.)种子脱水耐性获得过程中肌醇半乳糖苷合成酶活性与可溶性糖含量的变化

在这个研究中测量不同发育时期的油菜种子中可溶性糖含量与肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase,GOLS)活性,将二者的变化趋势与种子脱水耐性获得的过程相比较并对结果进行相关性分析。结果显示油菜种子脱水耐性获得过程中,葡萄糖和果糖含量均随着发育期的延长而下降,蔗糖则保持较高水平;肌醇含量下降而肌醇半乳糖苷含量上升;棉子糖系列寡糖(raffinose familyolig osaccharides,RFO)含量随着种子发育而上升,特别是水苏糖,在成熟种子中可以达到相当高的浓度。油菜种子发育中期,细胞内GOLS活性开始上升,至贮藏物积累完成时达到最大。GOLS活性变化与种子肌醇半乳糖苷积累速度、RFO含量及种子的脱水耐性呈一定的正相关关系。我们认为GOLS促使RFO积累,从而对种子脱水耐性的获得产生重要影响。

甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因CmGAS1的表达与功能分析

甜瓜(Cucumis melo L.)是棉子糖系列寡糖(Raffinose Family Oligosaccharides,RFOs)转运型植物。肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)是催化RFOs合成的关键酶。甜瓜CmGAS1基因(GenBank登录号为AY077642.1)的cDNA全长为1 903 bp,开放阅读框(ORF)为996 bp,编码331个氨基酸。CmGAS1蛋白分子量约为38 kD,理论等电点(pI)为4.81。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmGAS1氨基酸序列与黄瓜(AAO84915.1)亲缘关系最近,同源性为98.79%,与西瓜(Cla009222)同源性为97.58%。荧光定量结果表明,甜瓜叶片从幼叶(库)至成熟叶(源)CmGAS1的表达显著升高,第5节位叶片达到最大值。去掉50%叶片植株与对照相比,完全展开功能叶片的CmGAS1表达量明显升高。应用CmGAS1特异性启动子构建CmGAS1的过表达载体,并采用农杆菌介导进行甜瓜遗传转化,获得了PCR阳性转化植株,转化植株完全展开功能叶片的净光合速率以及叶片中的蔗糖、棉子糖、水苏糖含量与野生型相比均有所提高。推测CmGAS1在甜瓜叶片棉子糖系列寡糖合成过程中起重要作用。

苹果肌醇半乳糖苷合酶基因家族鉴定与表达分析

肌醇半乳糖苷合酶(galactinol synthase, GolS)是棉子糖家族寡糖(raffinose family oligosaccharides, RFOs)生物合成中的关键酶,在植物响应非生物胁迫的过程中发挥重要作用。本研究通过生物信息学的方法,基于本团队组装的耐寒优质苹果(Malus pumila)品种‘寒富’的基因组,对苹果Gol S基因家族成员进行鉴定、比较与表达分析。结果表明,‘寒富’基因组中共有42个MdGolS成员,它们分布于16条染色体上。系统发育分析表明, MdGolS基因家族成员分为三个亚家族,相同亚家族成员的保守基序的分布和种类较为一致。共线性分析表明,大片段复制现象是MdGolS基因家族扩增的主要动力。分析发现GolS基因启动子序列含有多种与植物生长发育、胁迫反应等相关的应激反应元件和激素响应元件。此外,结合冷冻处理的转录组数据发现,与不耐寒性品种‘长富2号’相比, MdGolS15、MdGolS22、MdGolS27、MdGolS35和MdGolS42仅在耐寒性品种‘寒富’中受到低温胁迫的强烈诱导,推测可能在响应低温中发挥重要作用。GolS基因家族的鉴定与分析为研究低温诱导RFOs合成代谢增强苹果耐寒性的机制提供研究基础。

酸枣肌醇半乳糖苷合成酶ZjGolS2基因的克隆及表达分析

肌醇半乳糖苷合成酶是催化棉子糖系列寡糖合成的关键酶,在植物抗逆生理过程中具有重要作用。本研究根据酸枣高温胁迫转录组数据,成功从酸枣幼苗叶片中克隆到1个肌醇半乳糖苷合成酶基因ZjGolS2,包含一个1017 bp的开放阅读框,编码338个氨基酸,蛋白分子量为38.82 kD,GenBank登录号为XM_016044622.2。系统进化树分析表明,酸枣ZjGolS2编码氨基酸与葡萄VvGolS3(Vitis vinifera,ARS22082.1)、海岛棉GbGolS(Gossypium barbadense,KAB1995026.1)亲缘关系最近。该基因在根、茎和叶片中均有表达,其中在叶片中的表达量最高;在45℃处理3和6 h后较对照表达量差异不显著,12和24 h后ZjGolS2基因表达量分别提高了1.82和2.08倍,这说明ZjGolS2受高温逆境诱导。同时本研究成功构建了表达载体pCambia-1300-ZjGolS2。本研究结果为进一步研究ZjGolS2基因的功能提供理论基础,并为提高果树耐高温能力和分子育种提供参考依据。

拟南芥肌醇半乳糖苷合成酶与棉子糖合成酶的体外催化活性比较

[目的]基因克隆及原核表达纯化后比较拟南芥的2个肌醇半乳糖苷合成酶及2个棉子糖合成酶的体外催化活性,为微生物法或酶法合成棉子糖尊定基础。[方法]RT-PCR克隆拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)的基因,分别构建原核表达菌株,诱导表达纯化获得酶,电泳检测及蛋白定量后进行体外酶催化反应,HPLC分析产物。[结果]克隆到GolS1与GolS3及RafS1与RafS5的基因,原核表纯化获得纯酶,以反应体系中目标产物生成速率衡量,GolS1与GolS3催化速率分别为0.51和0.28mmol/(mg·min),RafS1与RafS5的催化速率分别为0.45和0.21mmol/(mg·min)。[结论]拟南芥的肌醇半乳糖苷合成酶(GolS1及GolS3)与棉子糖合成酶(RafS1及RafS5)基因经异源表达后具有良好酶活,其中GolS1酶活是GolS3的1.82倍,RafS1酶活是RafS5的2.14倍。