葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因VvGolS2-4的克隆及表达特性分析

为了研究葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因家族的特性,以抗低温品种左优红组培苗为材料,通过同源克隆技术,获得VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4全长CDS,对其序列进行了生物信息学分析,同时利用实时定量PCR技术探究了3个基因的组织表达特性和响应逆境因子及相关信号分子的特性。结果显示:3个基因c DNA大小分别为954,978,1 011 bp,分别编码317,325,336个氨基酸序列;3个蛋白分子量分别为36.65,36.97,38.12 k Da;等电点分别为5.12,5.33和5.16,且均在C端含有一个疏水的五肽APXAA;实时荧光定量PCR证明,3个GolSs在葡萄不同组织中表达情况不同,VvGolS2和VvGolS4在叶片中表达量最高,而VvGolS3则在花和卷须中表达量最高;不同逆境因子及逆境信号分子均会影响VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因的表达量,其中VvGolS2和VvGolS4基因的表达受盐诱导最明显,VvGolS3基因的表达受低温诱导最明显;另外,胁迫信号分子乙烯、过氧化氢和脱落酸均可诱导VvGolS2基因表达量上升,而VvGolS3基因的表达受脱落酸和乙烯的诱导,乙烯、过氧化氢和硫化氢则均可诱导VvGolS4基因表达量上升。综上推测,3个Vv GolSs均与葡萄抵御逆境胁迫相关,但各自功能可能有所不同。

拟南芥中低温诱导肌醇半乳糖苷合成酶基因表达作用初探

研究了拟南芥中肌醇半乳糖苷合成酶基因(AtGol-3)在低温条件下表达量的变化。结果表明,AtGol-3基因受到低温胁迫诱导;并且AtGol-3基因在低温诱导晚期大量表达,这与其上游受到低温诱导相关的DREB/CBF和ABRE等转录因子的调控有关。

黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2克隆与表达调控

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是合成棉子糖系列寡糖(RFOs)的关键酶,在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探究GolS2基因在黄瓜应答非生物胁迫中的作用,本研究采用RT-PCR法从黄瓜中克隆了GolS2基因,其开放阅读框长度为981 bp,编码326个氨基酸,植物GolS2蛋白氨基酸序列一致性很高。进化树中,黄瓜GolS2蛋白与拟南芥GolS2和GolS3蛋白聚在同一分支,亲缘关系最近。盐胁迫和低温胁迫处理显著诱导GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达,但低温处理显著抑制GolS2基因在采后黄瓜果实中的表达。对其启动子顺式作用元件的分析结果显示,GolS2基因启动子中含有多个与逆境胁迫响应有关的顺式作用元件。在采后黄瓜果实中沉默HHO2和GRP3基因的表达,显著下调GolS2基因表达,表明这两个基因调控GolS2基因表达。本研究结果明确了GolS2基因在不同类型黄瓜组织中应答非生物胁迫的功能存在差异,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

刺齿报春苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因的鉴定及序列分析

肌醇半乳糖苷合成酶基因与植物光合产物运输、种子耐脱水性、抵御生物与非生物胁迫和自我保护等生理生化过程密切相关。基于刺齿报春苣苔(Primulina spinulosa)转录组测序数据,获得(鉴定)1个肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析结果表明,该基因全长1 347 bp(GenBank登录号为MG521418),开放阅读框(ORF)为1 008 bp,共编码335个氨基酸。进一步基于氨基酸序列的分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为38.05 ku,理论等电点为5.09,为亲水性蛋白,含有1个与糖基转移酶家族蛋白相同的保守结构域;刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因与同科的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica,FJ222452)的相似性高达90%,两者在系统进化树上聚为1支。研究结果为进一步研究刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子结构和功能奠定了基础。

烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1。NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近。这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础。

芝麻肌醇半乳糖苷合成酶基因SiGolS6的克隆及功能分析

【目的】SiGolS6是芝麻肌醇半乳糖苷合成酶家族成员,在植物抗旱过程中可能发挥重要作用。研究SiGolS6在植物干旱胁迫抗性中的功能,以期为芝麻抗旱遗传改良提供理论基础和基因资源。【方法】利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法从芝麻中克隆获得肌醇半乳糖苷合成酶基因SiGolS6。使用InterProScan、ClustalX2和MEGA5.2等生物信息学软件对序列进行分析。通过对转SiGolS6拟南芥材料的表型分析和生理指标测定,研究SiGolS6在植物抗旱性中的功能及作用机理。【结果】克隆获得SiGolS6的全长CDS序列为921 bp,编码306个氨基酸,其蛋白质分子量为35.07 kD,等电点为4.75。序列分析显示SiGolS6蛋白含有糖基转移酶保守结构域(IPR002495),属于糖基转移酶超家族。与其他物种GolS蛋白构建的系统进化树中,SiGolS6与马铃薯中的同源基因相似度较高。利用潮霉素筛选和PCR鉴定,获得6个独立的转基因拟南芥株系;qRT-PCR分析筛选出表达量较高的3个转基因株系(OE-2、OE-3和OE-4)用于后续试验分析,检测发现这三个转基因株系的棉子糖含量显著高于野生型植株。干旱胁迫下,转基因株系萎蔫程度较野生型轻,干旱胁迫28 d和复水恢复生长5 d后,转基因株系的鲜重均显著高于野生型,而正常供水条件下无明显差异;干旱胁迫28 d后复水生长5 d,50%的转基因植株基本恢复,而野生型植株存活率不到10%。干旱胁迫21 d,转基因植株的相对电导率,活性氧积累和相对MDA含量均显著低于野生型,而相对SOD、POD活性则显著高于野生型。【结论】在拟南芥中超量表达芝麻SiGolS6,能够提高植物在干旱胁迫中的耐受性。

大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS克隆及非生物胁迫表达分析

【目的】本文探索了大豆肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)基因与非生物胁迫的关系。【方法】通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增编码GolS的基因GmGolS。生物信息学分析预测该基因及编码蛋白的理化性质。构建系统进化树分析GolS蛋白的亲缘进化关系。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在非生物胁迫下的表达模式。【结果】GmGolS基因ORF全长987 bp,编码328个氨基酸,分子量38.03 kDa,等电点5.79。GmGolS蛋白定位于细胞的叶绿体和/或细胞质中,并且与沙冬青AmGolS蛋白的亲缘关系最近。干旱、高盐和低温胁迫均可不同程度的诱导GmGolS基因的表达,且GmGolS对干旱胁迫的响应最为明显。【结论】以上结果表明GmGolS基因在大豆中可响应多种非生物胁迫,为GmGolS在大豆抗逆基因工程育种中的进一步应用提供理论依据。

两个大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因的原核诱导表达

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉子糖系列寡糖(RFOs)生物合成途径中的关键酶,在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增获得编码GolS的GmGolS2-1和GmGolS2-3基因。添加酶切位点EcoRⅠ和SalⅠ,将GmGolS2-1和GmGolS2-3分别连入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析诱导浓度和诱导时间对蛋白表达的影响。结果表明:在诱导时间为3h,IPTG浓度为0.1mmol·L^-1时,可获得大量GmGolS2-1和GmGolS2-3的重组蛋白,分子量均大约为40kD。

泡核桃肌醇半乳糖苷合成酶基因克隆及表达分析

肌醇半乳糖苷合成酶是植物中棉子糖系列寡糖合成中的关键酶,在植物抗性生理中扮演重要作用。本研究利用RT-PCR技术从泡核桃中成功克隆获得一个受冷害诱导的肌醇半乳糖苷合成酶基因（Js GS1）,其含有1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸,登录号为：KX657831。该基因推断的蛋白与核桃（Juglans regia）GS蛋白的相似性为89%;系统进化树分析显示其与核桃、麻疯树（Jatropha curcas）、蓖麻（Ricinus communis）形成一个分支。半定量PCR显示：低温4℃处理3 h后有微弱表达,6 h后大量表达。这说明Js GS1是典型的受冷害诱导的GS基因。本研究为揭示泡核桃抗寒机理以及肌醇半乳糖苷合成酶在冷害胁迫下的作用提供帮助,并为利用基因工程手段培育抗寒新品种提供理论依据。

木薯中肌醇半乳糖苷合成酶基因在大肠杆菌中的表达

本研究利用从木薯中克隆到的肌醇半乳糖苷合成酶基因构建到高效表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeGolS5-p GEX,并对GST-MeGolS5融合表达的IPTG诱导浓度、诱导不同温度、不同菌液浓度和诱导时间等条件进行优化。研究结果表明:随诱导时间增长GST-MeGolS5融合蛋白表达量提高,在37℃时,OD600为0.4左右,诱导4 h MeGolS5-GST融合蛋白的表达量达到最大,在0.2 mmol/L IPTG浓度下,可以有效诱导MeGolS5-GST融合蛋白的表达;MeGolS5重组菌株可以耐受5%的PEG6000模拟的干旱胁迫。本研究结果可为解析MeGolS5基因的功能以及在木薯抗旱过程中的作用机理提供参考。

小桐子肌醇半乳糖苷合成酶3的基因克隆及其生物信息学分析和功能初步验证

旨在研究可溶性糖在小桐子抗冷性形成中的作用机制及其相关抗冷基因工程的应用。克隆了小桐子肌醇半乳糖苷合成酶家族成员3基因(Jc GS3)的全长c DNA,序列长1 053 bp,包含完整的开放阅读框1 008 bp,编码由335个氨基酸组成的酶蛋白(理论分子量为38 k D、等电点为5.44,含有典型的Dx D基序)。对其相应基因组序列中启动子区域进行分析,鉴定到了TATA框、CAAT框、CRT/DRE低温响应元件以及ABA应答元件等。进一步将其在酵母中表达,发现该基因的表达能够显著提高其重组酵母菌的低温抵抗能力。

甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因CmGAS1的表达与功能分析

甜瓜(Cucumis melo L.)是棉子糖系列寡糖(Raffinose Family Oligosaccharides,RFOs)转运型植物。肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)是催化RFOs合成的关键酶。甜瓜CmGAS1基因(GenBank登录号为AY077642.1)的cDNA全长为1 903 bp,开放阅读框(ORF)为996 bp,编码331个氨基酸。CmGAS1蛋白分子量约为38 kD,理论等电点(pI)为4.81。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmGAS1氨基酸序列与黄瓜(AAO84915.1)亲缘关系最近,同源性为98.79%,与西瓜(Cla009222)同源性为97.58%。荧光定量结果表明,甜瓜叶片从幼叶(库)至成熟叶(源)CmGAS1的表达显著升高,第5节位叶片达到最大值。去掉50%叶片植株与对照相比,完全展开功能叶片的CmGAS1表达量明显升高。应用CmGAS1特异性启动子构建CmGAS1的过表达载体,并采用农杆菌介导进行甜瓜遗传转化,获得了PCR阳性转化植株,转化植株完全展开功能叶片的净光合速率以及叶片中的蔗糖、棉子糖、水苏糖含量与野生型相比均有所提高。推测CmGAS1在甜瓜叶片棉子糖系列寡糖合成过程中起重要作用。

扬州大学发现黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶可通过促进同化物运输提高耐冷性

低温胁迫下,RFOs可在植物体内积累,起到渗透调节、失水保护或抗氧化等作用。RFOs又是黄瓜等葫芦科植物同化物的主要运输形式;因此,RFOs在这类植物的体内具有双重功能。肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是催化RFOs合成的关键酶,可被各种逆境诱导上调,同时也是黄瓜叶片同化物装载的关键酶。在黄瓜叶片中,GolS在低温等逆境胁迫下的变化机制有待探索。

普通烟草β-半乳糖苷酶基因(NtBGAL)的生信分析及其在不同组织及原核诱导的表达

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基因,随后利用生信工具软件分析其基因结构及蛋白理化性质,并采用qRT-PCR检测该基因在烟草不同组织部位(根、茎、叶和花)的表达模式,最后开展原核诱导表达、蛋白纯化及蛋白表征研究。【结果】克隆获得烟草NtBGAL基因,其与本氏烟草NbBGAL1基因同源性最高,二者具有相同的结构域(Motif);该基因定位于9号染色体上,含有18个内含子,mRNA长度为6649 bp,CDS长度为2541 bp,编码846个氨基酸,翻译的β-半乳糖苷酶属于GH35家族,NtBGAL蛋白的分子量为92.44 kDa,理论等电点(pI)为6.8,GRAVY为-0.222,定位于细胞壁。该基因在普通烟草不同组织部位的表达量为花>叶>茎>根,差异显著。在37℃下进行原核诱导,NtBGAL蛋白有明显表达;采用包涵体纯化方法获得较高纯度的NtBGAL蛋白。NtBGAL蛋白酶促反应最适温度为30~40℃,最适pH为4.0~6.5,Mn^(2+)浓度为0.05~0.15 mmol/L时对NtBGAL酶活性有增强作用。【结论】研究明确NtBGAL基因的组织表达模式及蛋白表征,为进一步通过改造NtBGAL基因,利用普通烟草生产人源化糖蛋白奠定基础。

水稻二半乳糖甘油酯合成酶DGD响应热胁迫的生物信息学和基因表达分析

利用比较基因组学方法获得5个水稻二半乳糖甘油酯合成酶（Os DGD）同源基因;运用生物芯片分析,发现Os DGD参与对热胁迫和干旱胁迫的应答;采用实时定量PCR技术,分析5个Os DGD在热胁迫幼穗6~7期日本晴、9311和N22水稻剑叶中的表达特征,发现Os DGD1、Os DGD2和Os DGD3在耐热品种N22中的表达明显受到热胁迫诱导,由此推测,Os DGD可能参与了水稻的耐热信号传导。

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α 半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上 ,尝试了基因工程α 半乳糖苷酶在 5L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α 半乳糖苷酶的研究。在 4L无机盐培养基中接种 0 .4LpPIC9K Gal GS115培养物 ,最终得到 3 .5L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为 2 .1g L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点 ,设计了如下的纯化流程 :离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带 ,总回收率 41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后 ,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明 ,从发酵液中纯化的α 半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α 半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。

二苯乙烯苷对D-半乳糖拟痴呆小鼠海马基因表达的影响

目的 应用cDNA芯片探索二苯乙烯苷(TSG)干预D 半乳糖皮下注射的拟痴呆 (AD)小鼠海马的靶基因。方法 D 半乳糖 (5 0mg·kg- 1·d- 1,6 0d)皮下注射为模型组 ,造模加TSG (0 .1g·kg- 1·d- 1)灌胃为TSG组 ,对照组只注射相同体积的生理盐水。每组 6只小鼠用Morris水迷宫测试学习记忆能力。取海马组织抽提RNA ,掺入荧光分子Cy3和Cy5逆转录合成cDNA探针。以模型比正常组和TSG比正常组为组合混合探针 ,与两张小鼠 4 0 0 0点cDNA芯片杂交 ,经荧光信号扫描及GenePixPro3.0分析TSG组AD疾病相关基因调控得到改善的基因。结果 TSG可缩短小鼠游至目标的距离和时间 ,说明改善了学习记忆能力。TSG组与模型组表达差异的基因有 2 9条上调 ,12条下调 ,其中与AD相关的有 11条。结论 基因表达结果说明 ,TSG可能使能量代谢与神经营养作用增强 ,炎性反应和转录整体水平下降。

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙带菜中的稳定表达

借鉴海带遗传转化模式 ,利用基因枪法将 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入裙带菜雄配子体中 ,一部分诱导形成营养增殖的丝状体 ,另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明 5 %的孢子体个体和 30 %的丝状体细胞表现了lacZ的稳定表达 ,利用PCR和PCR Southern检测得到了预期的阳性信号。本文结果提示了利用基因枪转化方法 。

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 .

原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化。利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞。结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D600为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时。纯化后α-半乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg。该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞。结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶。